EZ纳米孔测序FAQ

Plasmid-EZ 测序 FAQ
Primer Walking-EZ 测序 FAQ
PCR-EZ 测序 FAQ

Plasmid-EZ 测序 FAQ

1. Plasmid-EZ全质粒测序原理是什么？

金唯智全质粒测序使用的是Oxford Nanopore Technology (ONT)纳米孔测序。Nanopore序列测定依赖于电流信号到碱基序列信号的转换。其核心是让单链核酸分子在马达蛋白驱动下穿过纳米孔，不同碱基（A、T、C、G 等）因结构差异，通过时会导致跨膜电流发生特征性变化。电极实时捕获这些电流信号，再经算法分析信号的幅度、持续时间等特征，推断出碱基类型。该技术无需 PCR 扩增，可直接实现单分子实时测序。

Plasmid-EZ使用ONT平台最新R10测序芯片与kit14试剂，原始测序准确度为99.5%，经一致性分析单分子准确性可提升至99.9%。

通过我们对测序数据进一步分析组装矫正得到一个高质量的一致性序列，准确度大大提升，与Sanger测序确认正确的参考序列比对，序列一致性高于99.9972%。

  • 最快1天可出结果，快速高效
  • 不需要提供已知序列信息或测序引物
  • 样本通量可灵活调整
  • 测序对质粒大小、结构复杂度（高GC、ITR序列等）无限制
  • 为质粒质检提供更全面的信息
  • 质粒结构具有高准确度
测序方法对比
特点 Sanger 测序 Plasmid-EZ
测序区域 一般仅针对目标基因，可通过 Primer walking 多反应测序拼接获得完整质粒 可直接测完整质粒
引物要求 是 否
PCR 要求 是 否
通量 低 高
识别插入元件的方向 无法识别方向 是
解析结构复杂区域 否 是
测出多聚体质粒 否 是
测出混合质粒或杂质 DNA 否 是
周期 以 4 个反应为例：3-4 天 最快 1 天

环状质粒

  • 质粒单一，无基因组污染或降解（推荐使用Qubit定量，避免浓度虚高）
  • 片段≤10Kb：浓度≥20ng/μl，体积≥20μl；
  • 片段10Kb-20Kb之间：浓度≥30ng/μl，体积≥20μl；
  • 片段≥20Kb：浓度≥40ng/μl，体积≥20μl；
  • 纯度要求：OD260/280为1.8-2.0，OD260/230≥2.0。

 

菌液/平板菌落（片段≤20Kb）

  • 菌液：提供体积≥200μl新鲜菌液（OD＞0.8），装于1.5ml离心管中封口保存；
  • 直抽菌液：过夜培养的新鲜大肠杆菌菌液2ml或2ml菌液的沉淀；
  • 平板菌落：单菌落，无明显卫星菌落，需将待测的菌落圈选标注并编号。

仅测感兴趣的区域，无法排查载体骨架区域的潜在错误（碱基突变/插入/缺失），进而导致耽误实验进程。质粒插入片段正变得越来越长、越来越复杂，牛津纳米孔技术（ONT）测序成本低且非常适合解决长片段和难度的重复序列测序。Sanger测序无法确认质粒是否为多聚体，ONT能帮忙确定您的质粒是否为多聚体或混合质粒，避免质粒误用造成实验成本的额外浪费。

1-2 BD

原始数据自发货之日我们免费为您保存1个月，超期数据将默认被清理。收到数据后，请您及时查看和下载，避免耽误您的实验进程。3个月内的超期数据，您可以联系技术支持尝试线下付费查找（收费100元/份订单）。

您可以查阅金唯智的Plasmid-EZ快速入门指南链接。

由于纳米孔测序原始测序读长存在一定比例的随机突变，提供的突变信息为参考值，具体变异建议以Sanger或NGS验证结果为准。

组装结果也有可能包含多个序列，如果出现这种情况，genome文件夹中的fa格式的文件将包含所有组装好的结果序列。

在SnapGene Viewer中打开此文件，您将看到所有结果序列的列表，以及来自组装程序的一些详细信息。

 

若组装得到了两个结果序列：一个是完整的环状质粒，另一个并非完整环状序列。那么，第二个结果序列很可能是组装过程中产生的组装伪像，而非真正的变异。

 

相反，如果看到多个环状组装序列，且原始数据长度分布中能看到对应各自长度的数据峰，则这可能代表样本中存在多个质粒。

 

如果所有结果序列都只有少量reads，则可能表明样本的组装质量较低或样品本身数据量较少。

正常样本的reads分布图以及胶图如下，可以看到reads分布有明显的主峰，短片段比例较低，胶图条带清晰，供参考。

正常样本reads长度分布图

正常样本胶图

组装失败的最常见原因是样本浓度未达到所需的送样要求，或存在样品浓度虚高，或质粒出现降解等。浓度过低可能导致建库过程中片段化加剧及/或样本测序读长（reads）数量不足。我们强烈建议您在送样前使用Qubit或等效仪器检测样本浓度，以降低失败风险。

 

从测序读长长度分布图可一定程度上解释出现不同组装结果的原因：左图测序读长峰形单一，表明样本为单克隆质粒，通常可成功组装；中图出现多个峰，说明样本中可能存在片段缺失、重组或多聚体质粒等情况，可能出现多条组装结果；右图测序读长以短片段为主，不存在主峰，说明样本中可能存在严重降解或浓度虚高等情况，高概率会导致组装失败。

Plasmid-EZ无论测序成功或失败均会正常收费。为了提高测序成功率，建议您送样前对质粒进行凝胶电泳，预先排除降解或浓度虚高问题。

文件夹 文件类型 文件说明
genome .fa 组装出的一条一致性序列结果，可通过 SnapGene 软件打开。
bam .bam 结果比对文件（.bam），通过 IGV 软件打开，可了解样本的测序深度、每条 read 的序列一致性、突变位点等信息。
position .Base-composition.xls 质粒基因各位置的测序碱基组成统计文件，文件可通过 Excel 软件打开。
rawdata .fq 原始数据文件，建议使用记事本或者 SnapGene 打开。
report .html 分析报告，建议使用 Chrome、Edge 等打开。
ab1 .ab1 色谱图，基于测序结果模拟生成的文件，可通过 SnapGene 软件打开。

浓度低的样品可能会造成在混样中占比过低导致测序覆盖深度低甚至组装失败。

该服务适用于单克隆质粒样本，也可以检测混合质粒样本。但如果提交混合质粒样本，则无法保证测序和分析结果。

(1) 如果样本中含有相似度非常高的克隆，比如载体相同，会导致组装过程中部分reads无法区分，组装不完整或错误；

(2) 如果目标克隆在混样中占比不高，可能会导致目标克隆数据占比过低，覆盖深度不够从而组装失败。

纳米孔测序易在甲基化修饰位点（特别是GATC序列），同聚物区域（poly区）出错或产生InDel。

 

对于poly区域，建议使用IGV软件查看测序数据比对质粒基因组组装序列的bam文件，或者直接查看Base-composition.xls文件，判断是否存在reads符合参考序列poly区域长度。若存在，则建议以参考序列为准。若参考序列中存在超长的poly区域，则建议使用Sanger或NGS等多种平台进行验证。

 

对于非poly区域出现的与参考序列不一致的位点，建议查看Base-composition.xls文件，建议根据reads数进行分析确定。

列名解释：

(1) ID：拼接序列ID；
(2) Site：拼接序列上的位置；
(3) Ref：拼接序列在该位置上的碱基；
(4) Depth：拼接序列在该位置的覆盖深度；
(5) A/T/C/G：支持该处为A/T/C/G碱基的reads数量；
(6) InDel：支持该处为单碱基缺失的reads数量；
(7) Mutation_Rate：拼接序列在该位置处的突变频率（%）-> (覆盖深度-支持原有碱基的reads数)*100/覆盖深度；
(8) Other_Variant：其他突变类型(包括插入以及大于1bp的缺失，例如”+T(3)”则代表3条reads支持在该位置存在一个T碱基的插入)。

牛津纳米孔技术最常见的错误模式包括：同聚物片段（尤其是长度＞8 bp的）中的缺失、Dam甲基化位点GATC处的错误，以及Dcm甲基化位点CCTGG或CCAGG中间位置的错误。随着牛津纳米孔技术（ONT）测序化学试剂和碱基识别软件的未来更新，这些局限性有望得到改善。

测序覆盖度高度依赖于最终用户在提交样本之前确定的样本质量，因此无法保证。正确提交的质量良好的样本通常会产生数百条的测序reads。

Plasmid-EZ服务正是检测质粒多聚体样本的有效方法，它可以产生较长的读长，也可以检测质粒内的大片的重复序列。通过查看原始数据长度分布信息可清晰了解质粒的聚体情况。

如果样本中存在比例较高的多聚体，可能会影响组装结果。

质粒低于50 kb可以测序使用此工作流程。如果测序大于50kb，请联系我们进行技术咨询。

因为基因合成或分子克隆过程中可能出现错误，不能保证测序结果符合您的预期或参考序列。

如下建议：

  1. EZ测序会在甲基化修饰位点，同聚物区域（poly区）出错；位点的不准，可以结合比对bam文件或者变异信息统计文件Base-composition.xls综合判断是否是测序错误；对于仍不确定的位点建议采用sanger测序来验证。
  2. 样本浓度低可能导致测序覆盖较低，即使组装得到序列，但由于测序深度不够组装序列准确性也会差一些，建议遵循我们推荐的样本要求来准备样本，来获得最佳的测序结果。

模拟峰图是依据碱基组成文件等生成，生成的.ab1格式结果目前适用于ABI Scanner、Chromas、SnapGene、Seqman等大众软件打开。其他软件打开可能会出错。

我们的原始数据是未经过过滤处理，所以部分的位点在依据碱基组成文件等生成时，碱基突变超过20%会被模拟出套峰，以便于查看。

如对此类位点存在疑问，可以采用Sanger进行验证。

Primer Walking-EZ 测序 FAQ

1. Primer Walking-EZ服务如果截取失败了是什么原因？

截取失败主要原因可能如下：

  1. 质粒的浓度比较低，导致整体数据量比较低，组装的序列和实际有差异，导致和引物序列不匹配。
  2. 提供的序列不准确：序列是目的片段上的序列，可能存在插入缺失等原因
  3. 提供的序列方向不对：上下游序列不是按照5’-3’的方向提供，或者提供的是一条链的序列

建议如下：

  1. 按照送样标准提供合适的样品浓度，保证最终的数据输出
  2. 引物序列优先骨架引物，按照需要的方向提供

截取失败后可以通过report报告查看reads数情况，如果reads数较低（低于50以下），可能是数据量低影响了组装序列。

如果reads数正常，可以再一次提供新的序列进行截取，如果二次失败，后续再需要尝试，会收取对应的费用。

多次截取失败，建议客户按照Plasmid-EZ服务获得全序列后进行比对，确认原因。

可以

环状质粒

  • 质粒单一，无基因组污染或降解（推荐使用Qubit定量，避免浓度虚高）
  • 片段≤10kb：浓度≥20ng/μl，体积≥20μl；
  • 片段10kb-20kb之间：浓度≥30ng/μl，体积≥20μl；
  • 片段≥20kb：浓度≥40ng/μl，体积≥20μl；
  • 纯度要求：OD260/280为1.8-2.0，OD260/230≥2.0。

 

菌液/平板菌落（片段≤20kb）

  • 菌液：提供体积≥200μl新鲜菌液（OD＞0.8），装于1.5ml离心管中封口保存；
  • 直抽菌液：过夜培养的新鲜大肠杆菌菌液2ml或2ml菌液的沉淀；
  • 平板菌落：单菌落，无明显卫星菌落，需将待测的菌落圈选标注并编号。

PCR-EZ 测序 FAQ

1. PCR-EZ为什么两端的序列会出现多碱基或者少碱基的情况？

这是由于分析平台导致，PCR产物两端的序列优先使用设计引物时的序列作为依据。

不可以，而且需要准确标记，准确的大小标记可以规避杂带的干扰；

如果客户是混合的产物，请咨询当地实验室，重新报价。

可以测序，但条带之间需要有差异；

最终的输出以实际的数据产出为准，和各个条带的浓度和整体的数据量有关；部分低浓度的条带可能会由于有效的reads数低，达不到组装的条件而无法组装；

可以使用PCR-EZ的服务来执行，但需要明确标注是酶切产物以及大小。

深度取决于平台和客户片段大小，如果是ONT平台，和数据量有关，比如1000bp的，按照3M每个样品，一般在1000X左右。如果是其他平台，常规片段(3K以下)一般在200-500X左右。但这些数值都取决于客户的模板质量和大小等因素。

未纯化PCR产物

主带清晰突出、明显，送样体积不少于20μl；

片段≤5kb：浓度≥25ng/μl；片段>5kb：浓度≥50ng/μl （浓度为Qubit测量值） 。

已纯化PCR产物

1.5ml管寄送DNA，送样体积不少于20μl；

纯度要求：OD260/280在1.8-2.0，OD260/230≥2.0；

片段≤1kb：浓度≥10ng/μl；片段>1kb：浓度≥25ng/μl（浓度为Qubit测量值）。

原始数据只有Plasmid-EZ是默认提供，Primer-Walking-EZ 和PCR-EZ默认不提供，如果需要提供，请在下单界面选择“是”，但会收取一定的费用。