定点突变

CRISPR/cas9基因定点修复原理：
CRISPR/Cas是一种原核生物的自适应免疫系统，抵御来自噬菌体或外源质粒的入侵。这个原核生物系统的已广泛被分子生物学所采用，目前已成为基因组工程最强大和最通用的平台之一。 CRISPR/Cas9是一种简单而快速的工具，不仅可对各种物种（动物、植物、微生物等）中的内源基因进行有效修饰（敲除、敲入、定点突变），对其进行优化还可实现强大的转录抑制或靶基因的激活。CRISPR/Cas9的简便性使其在许多领域广泛应用，包括基础研究，生物技术和生物医学^[1,2,3]。
CRISPR/Cas9编辑系统是在sgRNA（约20nt，与靶基因序列互补）的引导下，Cas9特异性切割目标基因，造成DNA双链的断裂（double-strand DNA breaks，DSBs），从而引起生物体内的DNA损伤修复。这种修复作用主要包括两种途径，一种是利用非同源重组（NHEJ）的修复，即易错修复，可能造成基因组的随机插入或缺失突变，这种方式常导致靶基因失去功能，基因敲除就是利用该修复机制^[1,2]。另一种是利用同源重组修复（HDR），即精准修复，借助外源引入一段与预期编辑位点上下游紧邻且高度同源的DNA修复模板（donor，可以是短单链DNA序列（ssDNA）或质粒）介导序列的替换或插入，基因敲入和定点突变就是利用该修复机制^[3]。

服务标准

	客户需提供	安升达交付	交付周期
标准服务	基因序列和NCBI ID 宿主细胞细胞株培养条件突变位点信息	基因定点修复单克细胞一株（纯合/杂合）细胞cofA文件测序结果	12-16周

*注：一般由客户提供宿主细胞系，如果需要由安升达提供宿主细胞系，需要额外收费。
*如果宿主细胞使用的是常规培养基，如：RPM1640、DMEM、MEM等无需客户提供，如果是特殊培养基及添加物，需要客户提供。

定点修复细胞系构建流程：

案例分析1：Analyses of point mutation repair and allelic heterogeneity generated by CRISPR/Cas9 and single stranded DNA oligonucleotides.

图1. 野生型HBB和镰状细胞HBB基因型及设计的sgRNA序列、ssDNA序列^[4]

K562细胞中的β珠蛋白基因（beta globin gene）是基因编辑的公认且众所周知的靶标，特别是关于镰状细胞病。 β珠蛋白基因的第六个外显子中的突变与镰状细胞病的发作有关（镰状细胞中为A，野生型细胞为T），因此，作者通过基因编辑手段模拟该发病过程。作者选择了脱靶率低的sgRNA序列。并标注了其产生的DNA双链断裂（DSB）位置，设计了72nt的ssDNA模板，最终筛选得到的#22阳性克隆的基因型^[4]。

图2. #22克隆的基因型鉴定结果^[4]
测序分析显示：#22克隆为杂合子，一种基因型成功突变，一种基因型发生InDels（插入GA），剩余一种基因型既成功突变又发生InDels（插入GCA）^[4]。

图３. 其他克隆的基因型鉴定结果^[4]

本实验一共筛选26个单克隆，其他克隆的基因型鉴定结果统计如上图^[4]。

参考文献：
[1] Nelly M. Cruz and Benjamin S. Freedman. CRISPR Gene Editing in the Kidney. Author manuscript, Am J Kidney Dis . 2018;71(6): 874–883.
[2] Hryhorowicz M, Lipinski D, Zeyland J, et al. CRISPR/Cas9 immune system as a tool for genome engineering. Arch Immunol.2017;65(3):233–240.
[3] Savi´c, N.; Schwank, G. Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Transl. Res.2016; 168,15–21.

[4]Bialk, P., B. Sansbury, N. Rivera-Torres, K. Bloh, D. Man and E. B. Kmiec. Analyses of point mutation repair and allelic heterogeneity generated by CRISPR/Cas9 and single-stranded DNA oligonucleotides. Sci Rep. 2016;6: 32681.

安升达提供的CRISPR/Cas9技术服务的授权来自Broad研究所。