AAV载体构建
基因治疗（Gene Therapy）是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病。腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）作为基因治疗的一种明星载体，对于人类攻克癌症或更多的重大疾病有着巨大的潜力。AAV质粒中的反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）完整性对rAAV (recombinant adeno-associated virus) 的构建至关重要。缺失突变的ITRs会降低完整AAV病毒的产量，增加非目的DNA包装的产生。
为此，GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、错误ITR的修复和rAAV质粒大量制备的方法——Hi-Fi技术，该方法的核心点不仅仅是制定了更简单、灵活和快速的克隆方案，而更重要的是发明了一种特殊的大肠杆菌细胞及其培养条件，使rAAV质粒的ITR在细菌中的扩增过程保持稳定，不易发生缺失。
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技术细节
GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、错误ITR的修复和rAAV质粒大量制备的方法——Hi-Fi技术，该方法的核心点不仅仅是制定了更简单、灵活和快速的克隆方案，而更重要的是发明了一种特殊的大肠杆菌细胞及其配套使用的AAV稳定剂，较现有的方法更能使rAAV质粒的ITR在细菌中扩增过程中保持稳定，不易再发生缺失（表1）。表1：5个随机AAV构建后ITR的正确性
| 感受态细胞 | 结果 | ||||
| Sample1 | Sample2 | Sample3 | Sample4 | Sample5 | |
| Sl3 | 0%(0/8) | 0%(0/8) | n/a | 100%(10/10) | 91.7%(11/12) |
| Sl4 | 0%(0/8) | 0%(0/8) | n/a | 100%(10/10) | 83%(10/12) |
| Sla | 0%(0/8) | 0%(0/8) | n/a | 100%(10/10) | 83%(10/12) |
| Sle | 0%(0/8) | 12.50% (1/8) | 100% (8/8) | 100% (8/8) | 100% (8/8) |
| B83 | 0%(0/8) | 0% (0/8) | 100% (8/8) | 87.50% (7/8) | 87.50% (7/8) |
| Hi-Fi | 87.5% (7/8) | 100% (8/8) | 100% (8/8) | 100% (8/8) | 100% (8/8) |
基于感受态细胞的对比数据，安升达进一步探索了Hi-Fi技术流程在转化筛选正确克隆过程中的能力。由于ITR本身的不稳定性，在质粒构建的过程中，会有发生突变的可能性。
原始质粒：
第一次转化结果：
目前安升达基于Hi-Fi技术可以提供rAAV的质粒构建，ITR区域的修复和rAAV质粒大量制备以及AAV病毒包装等相关服务。
技术流程
发货标准
服务优势
案例分享
1、项目类型：Hi-Fi 技术构建 rAAV 载体
目的基因以及ITR区域合成之后，构建AAV载体之后，再利用SmaI酶进行酶切后，验证条带大小。
图5: 酶切图，L1: undigested；L2: digested with SmaI and BsrGI；L3: ladder 5000
条带大小正确后，再利用sanger测序技术，测定目的基因和ITR区域序列：
图6：ITR区域测序图
上图可以看出，Sanger测序验证了rAAV左右两侧的ITR区域序列正确。从而确保rAAV载体构建正确。
2.、项目类型：Hi-Fi技术修复ITR序列
AAV原始质粒ITR缺失突变，常规PCR扩增很难直接完成序列修复，安升达通过特定修复方案及Hi-Fi技术流程，成功交付多例修复质粒。
