基因敲除：移码突变

CRISPR/Cas是一种原核生物的自适应免疫系统，抵御来自噬菌体或外源质粒的入侵。这个原核生物系统的已广泛被分子生物学所采用，目前已成为基因组工程最强大和最通用的平台之一。 CRISPR/Cas9是一种简单而快速的工具，不仅可对各种物种（动物、植物、微生物等）中的内源基因进行有效修饰（敲除、敲入、定点突变），对其进行优化还可实现强大的转录抑制或靶基因的激活。CRISPR/Cas9的简便性使其在许多领域广泛应用，包括基础研究，生物技术和生物医学[1,2,3]。
CRISPR/Cas9编辑系统是在sgRNA（约20nt，与靶基因序列互补）的引导下，Cas9特异性切割目标基因，造成DNA双链的断裂（double-strand DNA breaks，DSBs），从而引起生物体内的DNA损伤修复。这种修复作用主要包括两种途径，一种是利用非同源重组（NHEJ）的修复，即易错修复，可能造成基因组的随机插入或缺失突变，这种方式常导致靶基因失去功能，基因敲除就是利用该修复机制[1,2]。另一种是利用同源重组修复（HDR），即精准修复，借助外源引入一段与预期编辑位点上下游紧邻且高度同源的DNA修复模板（donor，可以是短单链DNA序列（ssDNA）或质粒）介导序列的替换或插入，基因敲入和定点突变就是利用该修复机制[3]。



服务标准
   客户需提供 安升达交付  交付周期 
 标准服务 基因序列和NCBI ID
宿主细胞
细胞株培养条件		 基因敲除单克细胞一株（纯合/杂合）
细胞cofA文件
测序结果		  8-10周
基因序列和NCBI ID
宿主细胞
细胞株培养条件 		  基因敲除阳性pool
细胞cofA文件
测序结果		   4-6周
 附加服务  –  额外单克隆交付  –
 Western blot/FACS抗体  敲除细胞株蛋白水平验证结果  1-2周
 –  敲除细胞株mRNA水平验证  1-2周

 

 
*注：一般由客户提供宿主细胞系，如果需要由安升达提供宿主细胞系，需要额外收费。
*如果宿主细胞使用的是常规培养基，如：RPM1640、DMEM、MEM等无需客户提供，如果是特殊培养基及添加物，需要客户提供。

 

敲除细胞系构建流程：

敲除细胞系构建流程

 
案例分析1：CRISPR-Cas9 Mediated NOX4 Knockout Inhibits Cell Proliferation and Invasion in HeLa Cells.
 
活性氧（ROS）参与了多种作为细胞内信号分子的生物过程。NADPH氧化酶负责产生活性氧，NADPH氧化酶4（NOX4）是NOX/DUOX家族的成员，其中包括7种亚型（NOX1-5和DUOX 1-2），而NOX4是最丰富的亚型之一并广泛表达NOX异构体。 NOX4负责生产H2O2，NOX4在肾脏中的表达特别高。因此很多研究集中于NOX4在肾脏生理和病理生理中的作用[4]。作者利用CRISPR技术对Hela细胞中的NOX4基因进行敲除[4]。

20210226-1

图1. [4]
  
针对NOX4的3号外显子设计2条sgRNA序列，如下，gRNA #1：5’-CACCGGCACATGGGTAAAAGGATG-3’；gRNA #2 ：5’-AAACTA TCCTTTTACCCATGTGCC-3’。sgRNA构建至 pX459 CRISPR/Cas9-Puro vector (Addgene, Cambridge, MA)。Hela细胞转染后的的PCR产物进行T7E1分析，使用Puro筛选阳性细胞，并分单克隆。测序结果和WB结果表明#1-2、#1-5、#1-6这三个克隆的NOX4基因均已成功敲除[4]。

参考文献：
[1] Nelly M. Cruz and Benjamin S. Freedman. CRISPR Gene Editing in the Kidney. Author manuscript, Am J Kidney Dis . 2018;71(6): 874–883.
[2] Hryhorowicz M, Lipinski D, Zeyland J, et al. CRISPR/Cas9 immune system as a tool for genome engineering. Arch Immunol.2017;65(3):233–240.
[3] Savi´c, N.; Schwank, G. Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Transl. Res.2016; 168,15–21.
[4] Jafari N, Kim H, Park R, Li L, Jang M, Morris AJ et al. CRISPR-Cas9 mediated NOX4 knockout inhibits cell proliferation and invasion in HeLa cells. PLoS One.2017;12:e0170327.

 

 

安升达提供的CRISPR/Cas9技术服务的授权来自Broad研究所。