ssDNA（长单链DNA）
ssDNA (Single-Strand DNA)作为基因敲入的模板,已被广泛应用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑中。研究表明ssDNA和传统的双链模板(dsDNA)相比,能够实现更高效、特异性更强的大片段敲入。尤其是在模式动物构建中,使用ssDNA能够显著提高敲入效率,并减少随机插入。
金唯智可提供高质量、多规格的ssDNA合成服务，最长可达10,000 nt。
ssDNA在CRISPR基因编辑中的优势
与双链DNA（dsDNA）相比，ssDNA在递送至细胞后表现出更低的细胞毒性
脱靶整合率显著降低，保障基因敲入结果的可重复性和可靠性
为同源重组（HDR）提供高特异性的基因敲入模板，确保精准编辑
作为高效供体，适用于靶向插入和基因替换等精准编辑需求
CRISPR基因敲入工作流程
CRISPR/Cas9编辑通过产生双链断裂（DSB），随后由细胞的内源性修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HDR）完成修复。然而，同源重组修复在自然情况下发生概率很低，对于外源遗传物质的插入仍有一定的挑战。
传统方法上，双链DNA（dsDNA）是基因插入的首选模板，但最新研究表明，单链核苷酸作为HDR的供体模板更具优势。ssDNA能够以更短的同源臂实现长序列的高效插入，因此已成为基因敲入的高效供体。
金唯智可提供最长达10,000 nt 的ssDNA片段，与dsDNA供体相比，可在插入长序列时显著提高效率，同时降低细胞毒性和脱靶整合风险。
服务详情
| 服务类型 | 长度 | 周期 | 规格 | QC标准 |
|---|---|---|---|---|
| ssDNA | 151-500nt | 2-3周 | 5μg起，干粉发货 |
Sanger测序正确 电泳纯度验证 单链消化酶纯度验证 内毒素100EU |
| 501-1000nt | 3-4周 | |||
| 1001-3000nt | 3-5周 | |||
| 3001-5000nt | 4-5周 | |||
| ≥5001nt | 咨询 |
服务优势
可以合成150-10,000 nt 长度的ssDNA，多种规格发货
两次Sanger测序验证，序列准确度100%
所有ssDNA均来源于单克隆质粒，酶切法制备，双链DNA残留率低于0.5%
可合成包括ITR，大片段正向重复、反向重复等在内的困难序列
制备流程
ssDNA应用案例
某胰腺癌癌细胞，基因N端敲入荧光蛋白，分别使用ssDNA和plasmid作为模板进行敲入
实验体系：20μl体系，细胞3*10^5，ssDNA和质粒均为 2-3 μg
实验结果：质粒donor，鉴定166个克隆，无正确插入；ssDNA donor，鉴定24个克隆，获得3个基因组完全正确的克隆
参考文献
1.Li H, Beckman KA, Pessino V, et al. Design and specificity of long ssDNA donors for CRISPR-based knock-in. bioRxiv 178905. doi: 10.1101/178905.
2.Mason DM, Weber CR, Parola C, et al. High-throughput antibody engineering in mammalian cells by CRISPR/Cas9-mediated homology-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. (2018);46(14):7436-7449. doi: 10.1093/nar/gky550
3.Miura H, Quadros RM, Gurumurthy CB, et al. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. (2018) 13(1):195-215. doi: 10.1038/nprot.2017.153
4.Roth TL, Puig-Saus, C, Yu R, et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature 559. (2018) 405–409. doi: 10.1038/s41586-018-0326-5.
