高通量测序

样品制备指南

DNA样品

DNA样品建议在-20℃环境中保存。短时间保存或运输可以使用湿冰或者冰袋，4℃保存或运输。长时间运输，建议采用干冰加冰袋的方式。
测序类型
 文库类型
 样品要求
基因组测序 小片段文库 核酸质量≥200ng以上，浓度大于10 ng/μl，体积大于10 μl。琼脂糖凝胶电泳DNA条带清晰无降解或轻微降解，无RNA和蛋白污染，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
Pacbio文库(10K 文库) 核酸质量≥5μg以上，浓度大于60 ng/μl，OD260/280比值 1.8-2.0，260/230 比值2.0-2.2。Nanodrop 浓度与 Qubit浓度比值≤2，样品澄清无色，无不溶解物；琼脂糖凝胶电泳DNA条带清晰无降解，无RNA和蛋白污染。
Pacbio文库(20K 文库) 核酸质量≥ 20 μg以上，浓度大于80 ng/μl，OD260/280比值 1.8-2.0，260/230 比值2.0-2.2。Nanodrop 浓度与 Qubit浓度比值≤2，样品澄清无色，无不溶解物；脉冲电泳DNA条带清晰无降解或轻微降解，大于30kb，无RNA和蛋白污染。
宏基因组测序 宏基因组样品建库成功率受样品来源和杂质含量等影响较大，成功率较常规gDNA 建库低 核酸质量≥100ng以上，浓度大于2 ng/μl，体积大于10 μl。琼脂糖电泳条带片段大小≥500bp。
16S/18S/ITS测序 对于达到QC 标准(基因组浓度大于0.05ng/ul)的样品，16S/18S/ITS测序同样存在扩增失败的风险 扩增结果体积≥15ul，扩增结果浓度≥10nM，且2100 峰图正常，基因组浓度大于0.05ng/ul。
染色质免疫共沉淀测序(ChIP-Seq)   核酸质量≥20 ng以上，浓度≥1ng/μl，体积≥10μl，主峰在100-500bp之间Smear条带。样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物，无蛋白污染。
全基因组甲基化测序   核酸质量≥1.5μg，浓度≥20ng/μl，体积≥10μl。琼脂糖凝胶电泳条带清晰无降解或轻微降解，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
外显子测序 基因组样本,基本无降解（数据量＜50G）
 核酸质量≥300ng以上，浓度≥2ng/μl，体积≥10μl。琼脂糖凝胶电泳条带清晰无显著降解或轻微降解，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
基因组样本,基本无降解（数据量≥50G）
 核酸质量≥1μg以上，浓度≥2ng/μl，体积≥10μl。琼脂糖凝胶电泳条带清晰无显著降解或轻微降解，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
FFPE等特殊样品允许一定程度的降解（数据量＜20G）
 核酸质量≥400ng，浓度≥4ng/μl，体积≥10μl。琼脂糖凝胶电泳条带在500bp以上。
FFPE等特殊样品允许一定程度的降解（数据量≥20G）
 核酸质量≥1μg，浓度≥4ng/μl，体积≥10μl。琼脂糖凝胶电泳条带在500bp以上。
扩增子测序 小片段直接建库(NEB) 核酸质量≥50ng以上，浓度≥2ng/μl，体积≥10μl。片段大小100bp-500bp之间，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
需要打断(NEB)(片段大小>1000bp) 核酸质量≥500ng以上，浓度≥20ng/μl，体积≥10μl。琼脂糖凝胶电泳条带清晰无显著弥散，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
插入位点检测   核酸质量≥400ng以上，浓度大于10 ng/μl，体积大于10 μl。琼脂糖凝胶电泳DNA条带清晰无降解或轻微降解，无RNA和蛋白污染，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。 
简化扩增子   核酸质量≥150ng以上，浓度≥10ng/μl，片段大小100bp-500bp（含搭桥引物）之间单一条带。
 Ampliseq-CRISPR（on/off target）   核酸质量≥200ng*N以上，N为检测位点数，浓度≥20ng/μl，体积≥10μl，OD260/2801.8-2.0之间。
gEdit-Screen   质粒：核酸质量≥100ng，浓度≥10ng/μl，琼脂糖电泳检测无降解或者轻度降解OD260/2801.8-2.0之间。
DNA：核酸质量≥N*X*0.07μg，浓度≥200ng/μl，琼脂糖电泳检测无降解或者轻度降解OD260/2801.8-2.0之间。
PCR产物：核酸质量≥50ng，浓度≥10ng/μl，条带单一。
抗体多样性评估（质粒）   浓度≥10ng/μl，琼脂糖电泳检测无降解或者轻度降解OD260/2801.8-2.0之间。
文库样品  

散样文库浓度大于3 nM(qPCR定量浓度)，包Lane文库浓度大于5 nM(qPCR定量浓度)，体积不低于15μl且样品中不含有磁珠，文库兼容相应的测序平台。其他注意事项：

1)DNA文库溶解于Illumina Resuspension Buffer(RSB)或其他品牌建库试剂盒的适当缓冲液中。

2)提供物种信息、片段大小、建库方式、Agilent 2100 Bioanalyzer质检图以及Qubit结果。

3)HiSeq文库大小介于300bp-500bp之间，MiSeq文库大小介于300 bp-600 bp之间，无引物二聚体及接头二聚体)。
                                                                                                           

 

RNA样品

RNA样品建议在-80℃以下的环境中保存。短时间保存或运输可以使用干冰或者液氮。长时间运输，建议将RNA沉淀于75%乙醇中，采用足量干冰或者蓝冰运输（2 kg/day）。

说明：
1．RIN值判定：
1）由于植物会出现多条核糖体RNA条带，故有时RIN值机器无法判读或者机器判读有误，此时我们会根据Agilent 2100电泳图来判定样本是否合格。
2）对于一些特殊物种，如：蚂蚁/蟹类等节肢动物、果蝇、鱼类等，28S rRNA会被修饰成比较小的片段（一般大小和18S相似），导致28S/18S小于1,因此 RIN值与样品实际降解情况不符，此类样本我们会根据Agilent 2100电泳图来判定样本是否合格。
3）对于一些经过特殊处理的材料，RIN值与样本实际降解情况可能不相符合，我们会根据检测结果的RIN值和降解情况进行判断。
4）个别样品Agilent 2100检测的图谱与琼脂糖凝胶电泳图带型不一致，可能是样品中某些成分影响仪器读数，不能反映样品真实的带型。此时我们会根据琼脂糖电泳图来判定样品是否合格。

测序类型
 物种类型
 样品要求
polyA筛选建库（适用于真核生物转录组测序）
 哺乳动物
 1.5 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 6.5，浓度 > 50 ng/μl，体积大于10 μl,5S峰正常。2100峰形正常，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
昆虫
 1.5 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 5，浓度 > 50 ng/μl，体积大于10 μl,基线平整，5S峰正常。2100峰形正常，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
植物、真菌、酵母菌、其他动物
 1.5 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 6.5，浓度 > 50 ng/μl，体积大于10 μl,5S峰正常。2100峰形正常，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
rRNA去除建库（适用于真核lncRNA测序及原核生物转录组）
 真核生物(lncRNA)
 2 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN >6.5，浓度 > 100 ng/μl，体积大于10 μl,5S峰正常。
原核生物 2 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 6.5，浓度 > 100 ng/μl，体积大于10 μl,5S峰正常。样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
小RNA测序
 哺乳动物
 2 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 7.5，浓度 > 200 ng/μl，体积大于10 μl,5S峰正常。样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
昆虫 2 μg以上，260/280 ≥ 2.0， 浓度 > 200 ng/μl，体积大于10μl,基线无上抬，5S峰正常。样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
植物、真菌、酵母菌、其他动物
 2 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 7.5，浓度 > 200 ng/μl，体积大于10 μl,5S峰正常。样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
宏转录组
 由于受样品来源和杂质含量等影响较大，宏转录组样品建库比常规转录组建库成功率要低
 2 μg以上，浓度≥100ng/μl，体积≥10μl，琼脂糖凝胶电泳样本轻中度降解，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
全长转录组测序   核酸质量6μg以上，浓度≥280ng/μl，260/280 ≥ 1.8，260/230≥1.8 RIN >8，体积大于10μl,5S峰正常。
全转录测序 真核生物转录组、表达谱测序， Ribo-zero去除rRNA 核酸质量≥2μg，260/280 ≥ 2.0， RIN值 ≥ 6.5，28S/18S ≥1.0，浓度 ≥ 100 ng/μl，体积≥10μl,5S峰形正常。
  小RNA测序 核酸质量≥2μg，260/280 ≥ 2.0， RIN值 ≥ 7.5，28S/18S ≥1.0，浓度 ≥ 200ng/μl，体积≥10μl,5S峰形正常。样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
免疫订单
 常规起始量建库
 核酸质量≥2μg，260/280 ≥1.9， RIN值 ≥ 7，28S/18S ≥1.0，浓度 ≥ 100ng/μl，体积≥10μl,5S峰形正常。样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
  低起始量建库
 核酸质量≥500ng，260/280 ≥ 2.0， RIN值 ≥ 7.5，28S/18S ≥1.0，浓度 ≥ 50ng/μl，体积≥10μl,5S峰形正常。样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
 免疫组库及杂交瘤测序
   核酸质量≥1ug，浓度 ≥ 100ng/μl，琼脂糖凝胶电泳条带清晰无显著降解或轻微降解，样品澄清无色，无粘稠，无不溶解物。
                                                                                     

 

组织样品

组织样品根据后续实验需要，如果需要提取DNA，短时间保存或运输可以使用冰袋，4℃保存或运输；长时间运输建议采用干冰加冰袋的方式。如果需要提取RNA，请使用干冰或液氮运输，并参考合同中的送样要求。
特殊样品或有潜在致病性的样品，请跟安升达专业团队沟通确认送样和运输要求。
请将样品名称标记清楚，将样品管置于50ml离心管或样品盒中，再用泡沫塑料或棉花等妥善包裹，保证样品到达实验室的时候状态良好，不破不漏。

DNA

不同类型样品DNA产量差异较大，请根据样品实际情况酌情送样，并保证能够提取得到对应测序文库构建所需要的DNA产量。用于DNA相关测序服务的组织样品，无特殊说明，均采用冰袋运输。

样品类型 样品要求（DNA）
血液 2 ml以上新鲜或者冷冻保存的抗凝血(全血或从全血中提取的白细胞)，推荐使用EDTA抗凝剂，不能用肝素抗凝，以免影响实验。
离体组织 0.5 g以上动物组织，2g以上植物组织。
细胞 5X106个以上。
细菌样品 1 g以上菌体沉淀(大约10ml以上对数生长期菌液离心);Pacbio文库：需要15 g以上菌体沉淀(大约150ml以上对数生长期菌液离心)。
FFPE 样品 至少10张未经HE染色处理的切片，厚度不小于5微米,切片上组织区域面积应大于等于25平方毫米，其中有核细胞的数量占所有细胞的80%以上，肿瘤细胞组织区域的含量在70%以上。
16S/ITS/18S测序样品 常规样品2 g以上沉淀，水样10 ml以上，根据微生物丰度具体确定。
宏基因组样品

环境样本：土壤： 5-10g;粪便：3-5g ;沉积物：5-10g;液体：25mL。

水体：选0.22μm或0.45μm的滤膜，过滤，水样体积5-10mL，最适滤膜面积3-4cm。
其他类型样品请咨询安升达项目管理团队。

                             

叶绿体提取与高通量测序样品要求

60g以上幼嫩叶片，遮光生长24h，新鲜取样后冰袋寄送，选择最快的送样方式。为了确保实验室能在收样当天进行处理，请确保样品在周一到周四期间到达实验室。叶绿体DNA文库构建用量与常规DNA文库构建用量相同。

RNA

不同类型样品RNA产量差异较大，请根据样品实际情况酌情送样，并保证能够提取得到对应测序文库构建所需要的核酸产量。用于RNA相关测序服务的组织样品，无特殊说明，均采用干冰或液氮运输。

样品类型 样品要求（RNA）
血液 5 ml以上全血收集的淋巴细胞，鸟类或鱼类可适当减少送样量。建议将淋巴细胞用20倍体积TRIzol LS充分裂解。客户也可以直接寄送液氮速冻的全血样品，建议向新鲜血液中加入3倍体积的TRIzol LS裂解液，干冰寄送，并承担提取风险。
新鲜组织
 动物组织500 mg以上，含肌纤维或脂肪等组织的样品RNA含量较低，送样量需增加。植物组织1 g以上，含多糖多酚等的复杂植物组织，请尽可能多的送样。新鲜组织建议清洗后用锡箔纸包裹或EP管分装，在3 min内进行液氮速冻。
细胞 5X106个以上。请清洗后离心沉淀，用TRIzol充分裂解并寄送。
细菌样品 500mg以上新鲜菌体沉淀（大约5ml以上对数生长期菌液离心) ，在3min内进行液氮速冻。菌类样品不建议保存于TRIzol裂解中送样。
免疫组库高通量测序样品
客户自行收集血液中的PBMC细胞，细胞总数在1X106-5X106之间，用1ml TRIzol充分裂解，干冰寄送。
其他类型样品请咨询安升达项目管理团队。

                     

 

高风险样品

下列高风险样品请您自行提取RNA，如您坚持送样，需承担提取风险和责任，正常收费。
样品类型
 说明
常年保存或反复冻融样品 RNA质量会受影响，提取风险加大，不建议送样。
微量组织 动物组织量<20 mg，植物组织量<20 mg，细胞数<105，全血量<2 mL（鸟类），全血量<3 mL（其它动物）等。主要针对珍贵稀缺样本，鉴于样品特殊和珍贵程度，此类样品不接收RNA提取工作，请您自行提取。
困难或特殊样品 多糖多酚含量异常高的植物老根、成熟米粒、花粉、花蕾、种子、青稞、草莓果实、松树、藻类、棉花组织、菌类，成分异常复杂的肿瘤组织，牛奶，尿液等。鉴于此类样品提取方法不成熟，为免来回送样影响合作伙伴研究进度，请您自行提取。
血浆、尿液等液体 RNA提取风险较大，得率很低。建议使用Trizol LS等处理液体样品效果好的裂解液进行处理，使用比例（体积比）Trizol LS：液体样品=3：1。如是全血等杂质较多的样品，请事先用RNase-Free Water进行1：1稀释。

               

 

寄送信息

寄送要求：
所有样品必须附带一份《安升达高通量测序样品信息单(组织或核酸)》，若是自建库的文库测序样品，需附带《安升达高通量测序样品信息单(文库测序)》；请详细填写信息单上所要求的各项样品信息，包括样品编号、管数、浓度、体积等，随同样品一起寄出，并将电子版发送至NGS.Service@Azenta.com。

样品包装说明：
请将样品名称标记清楚，将样品管置于50ml离心管或样品盒中，再用泡沫塑料或棉花等妥善包裹，保证样品到达实验室的时候状态良好，不破不漏。

通过快递直接寄送（顺丰）：
如果您所在地点附近没有样品箱，或者您的起始材料需要干冰保存，请使用快递服务，例如顺丰快递。

通过安升达样品箱（如有）：
在室温下稳定的起始材料可通过安升达样品箱（如有）提交。如需询问您所在地点附近的样品箱取件服务，或者您对样品箱有任何疑问，请联系Public.Sales@Azenta.com。

邮寄地址：

收 件 人 ：安升达高通量测序服务
联系电话：15599039790
收件地址：江苏省苏州市苏州工业园区科教创新区酝慧路8号
邮 编      ：215000

Hiseq 及NovaPE150文库测序样本邮寄地址： 

收 件 人 ：安升达高通量测序服务
联系电话：18550199367
收件地址：江苏省南京江北新区浦滨路211号基因大厦二楼215
邮 编      ：211500 

如果您有疑问或需要咨询项目相关事宜，可以随时联系安升达的项目管理。请发送邮件至NGS.Service@Azenta.com或拨打安升达的免费服务电话400-8100-669选项3。 安升达期待与您的合作！