LIBRA-seq快速开发单克隆抗体-【技术解读】
抗体发现和疫苗开发对人类生存的意义不言而喻，疫苗是预防控制传染病最有效的手段。而抗体除治疗感染疾病外，在癌症治疗领域也发挥重要作用。
传统的抗体发现平台包括杂交瘤技术、体外展示技术和转基因小鼠技术，其抗体序列发现周期都较长，3-6月的时间不等。对于流行性突发性疾病，我们期待的是快速发现抗体序列。那高通量单B细胞测序就进入到我们视野。
图1.传统杂交瘤技术平台（图片来源：GENEWIZ）
单B细胞受体测序的筛选方法不需要杂交瘤或者组合显示，可以直接获得天然抗体库，快速发现抗体。首先直接从恢复期病人血浆中获得PBMC细胞，通过流式细胞仪筛选和抗原特异性结合的B细胞，然后进行单细胞分选。单B细胞的筛选方法可以将抗体发现周期缩短到4周左右。
虽然B细胞受体(B cell receptor，BCR)测序是免疫反应识别感染和疫苗接种的强力工具，但从BCR序列到抗原特异性获取的信息有限。为了克服这一难题，2020年美国Vanderbilt大学医学中心的Ian Setliff博士的团队在Cell上发表文章《High-Through put Mapping of B Cell Receptor Sequences to Antigen Specificity》，公开了一种高效快速完成单克隆抗体制备的新技术：LIBRA-seq。
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LIBRA-seq
LIBRA-seq(linking B cell receptor to antigen specificity through sequencing，BCR到抗原特异性连接测序)，它可以高通量映射成对重链和轻链BCR序列与其同源抗原特异性。基于LIBRA-seq，研究人员在一个星期内即可筛选出针对不同抗原的抗体序列，直接关联抗原特异性，同时可用多种抗原一起筛选广普抗体。
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LIBRA-seq的方法原理
1.抗原做荧光修饰和寡核苷酸修饰
通过生物素和链霉亲和素连上PE荧光染料；寡核苷酸链包括PCRhandle(链接抗原)、barcode序列和捕获序列(能和beads上的序列互补配对，被bead“捕获”)；
2.抗原抗体孵育
提取有免疫反应的患者的外周血单核细胞，并与不同的抗原混合孵育；
3.流式分选
在1中抗原已经标记上了荧光染料，这时那些和抗原发生免疫反应的B细胞在流式细胞仪会被分选出来；
4.单细胞分选
流式分选出来的混合液上10X Genomics仪器进行单B细胞-抗原处理，形成一个个的油包水的微滴，每个微滴中有单个的B细胞，带有寡核苷酸修饰的抗原、带标签的凝胶微珠；
5.高通量测序
构建V(D)J文库和抗原文库：beads捕获RNA后反转录，用人抗体库引物设计特定PCR扩增所有V(D)J序列，构建V(D)J二代测序文库；beads捕获抗原上capture sequence，扩增加接头序列，构建抗原二代测序文库。也可同时构建转录组文库，做IgG、BCR轻链和重链mRNA表达水平间相关性分析。
6. LIBRA-seq评分
高评分的序列可能为高抗原特异性抗体；通过蛋白表达系统，得到目标抗体。
图4.LIBRA-seq分析示意图 （图片来源：参考文献[1]）
为了证明LIBRA-seq方法的有效性，研究者们绘制出了来自两名HIV感染者血液中数千个抗原特异性B细胞。从不同角度对两组数据进行比较后，证明利用LIBRA-seq方法，可以快速高效地发现HIV和流感特异性抗体，包括已知和新的广泛中和抗体。
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研究内容
样本：捐赠者N90的外周血单核细胞
样本信息：之所以选择这个样本，是因为之前从这个供体中分离出一个针对V1/V2表位的广谱中和抗体VRC38；但是供体N90血清中的病毒中和广度要大于VRC38的中和谱宽度，这表明捐赠者体内有其他的bNAb谱系。
实验目的：确认LIBRAseq是否能实现两个目标，(1)从VRC38普系中回收抗原特异性B细胞(2)鉴定新的广谱中和抗体。
实验设置：抗原筛选库由HIV和流感两种类型共九种抗原组成，分别修饰了不同的barcode序列
图5.筛选文库中的九种抗原 （图片来源：参考文献[1]）
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结果展示
1. 发现新的抗HIV的抗体
结果如下图所示，每行代表一个抗体，鉴定了18个VRC38谱系B细胞，并检查其与已知谱系成员的系统发育相关性以及序列特征。系统发育树显示了先前鉴定的VRC38谱系成员(黑色)和LIBRA-seq鉴定成员(红色)的相关性。
图6.系统发育树 （图片来源：参考文献[1]）
2. LIBRA-seq得分和ELISA验证之间具有高度的一致性
从下图中可以看到，LIBRA-seq得分和ELISA测量值之间几乎完全对应，也就是说将LIBRA-seq得分的抗体序列通过基因工程表达出来后，抗体和目的抗原的亲和力较高，和ELISA验证结果相吻合。
图7.供体N90新鉴定抗体的序列特征和抗原特异性 （图片来源：参考文献[1]）
3. 捐赠者体内广谱中和抗体宽度
图中左下侧为五种抗原蛋白：B41、BM106.9、BG505、KNH144、ZM197，均属HIV蛋白；具有高LIBRA-seq分数(R1)的B细胞数量显示为条形图；每个黑色圆点表示有相互结合的，从图片可以看到最右边条型柱抗体能和5种抗原蛋白相结合。LIBRA-seq的得分可以预判广谱中和抗体的宽度。
图8. 广谱中和抗体 （图片来源：参考文献[1]）
更多实验细节和结果分析可自行查看原文章[1]。
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小结
LIBRA-seq是一种革命性的开发单克隆抗体的新方法，LIBRA-seq得分可以直接显示抗体与抗原结合的特异性，节省了抗体亲和力验证筛选，同时一次可以用多种抗原筛选抗体库找到广谱抗体信息。
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金唯智案例展示
为了使LIBRA-seq方法快速应用到实际的单克隆抗体开发中来，今年GENEWIZ协助客户完成了LIBRA-seq流程里单细胞测序及抗体表达部分。在这个过程中，我们建立了基于抗原feature barcode标记的单细胞抗体测序建库和QC流程，搭建了基于feature barcode的单细胞抗体测序生信分析流程，验证了可能与抗体亲和力相关的分析指标(Enrichment/HMR/Feature)，积累了丰富的Libra-seq实验流程经验，以下是两张主要的实验结果：
1.测序获得所有重链和轻链全长序列，对比分析IgG Germline突变率完全符合B细胞分化理论；
2.ELISA验证libra-seq测序获得的抗体与抗原亲和力
更多详细信息可咨询NGS.Service@genewiz.com.cn，电话400-8100-669转3
参考文献：
[1] Setliffet al.(2019).High-Throughput Mapping of B Cell Receptor Sequences to AntigenSpecificity samples.Cell 179, 1–11
