疫情之下，生物制药的研发成为焦点。在创新药领域，细胞和基因治疗是推动行业发展的两大最具革命性的应用。不同于传统的化药和大分子药作用机理，细胞和基因治疗直接靶向DNA/RNA，通过改变DNA来改变最终蛋白质的性状，为治疗大量目前无法医治的疾病提供了全新的治疗方案。

6月22日，国家药监局（NMPA）公示复星凯特CAR-T细胞治疗产品正式获得批准，中国迎来首款获批上市的CAR-T细胞治疗产品，这意味着我们正式开启了免疫细胞治疗的全新时代。

细胞和基因疗法可进一步分为体内治疗和体外治疗，体外治疗是将患者的体细胞从体内分离，在体外进行培养并使用携带有正常基因片段的载体修复突变基因，最后通过注射的方法将改良后的细胞回输入患者体内以进行疾病的治疗。体内治疗是利用较为直接的方法对局部或全身注射含有修复基因片段的病毒或非病毒载体，常用AAV等非整合型载体。

图片来源：参考资料[1] 

 

利用慢病毒载体导入外源序列时其插入位置具有随机性，可能会引起正常基因失活，如果插入某些控制细胞分裂的基因中会导致癌变。所以检测重组细胞的整合位点来评价细胞的安全性就显得尤为重要。在国家药典委员会公布的《人用基因制品总论》（草案）的3.1条款中，特别指出：“应检测重组载体基因组或质粒的完整性和均一性，载体和治疗序列的遗传稳定性”；“对于病毒载体，适当情况下应测定插入位点，并充分评估插入突变的可能性和相关风险”。

对此，金唯智自主创研，可分别采用宿主细胞全基因组重测序方法和LM-PCR结合二代测序方法为研究人员提供整合位点检测服务。通过测序分析可对整合位点相关基因进行功能分析，对整合位点偏好性画像，从而评估病毒载体的安全性。

全基因组测序是对重组细胞的基因组DNA进行深度测序，技术成熟简单这里不做介绍了，我们分享一下LM-PCR结合二代测序的检测方法。

LM-PCR全称连接介导的PCR。将含有慢病毒插入的基因组进行随机打断并连接接头，然后通过两轮PCR富集含有慢病毒LTR-宿主区域的嵌合序列。此扩增产物进行二代测序即可以分析确定载体在宿主基因组上的整合位点。

LM-PCR与高通量测序技术相结合后，有了更为丰富的应用场景。比如，识别整合载体（慢病毒载体，转座子）的整合位点。该技术广泛应用于基因治疗研究基因修饰细胞的克隆组成，或者通过研究整合事件评估新载体系统的生物安全性。

图1  LM-PCR原理 图片来源：参考文献[2]

 

相较于LM-PCR方法，重组细胞全基因组重测序需要较大数据量，比较适合用于经过表型筛选的单克隆细胞的测序，比如用于抗体药物生产重组CHO细胞的位点检测，但全基因组测序可对宿主基因组自身的变异进行检测。

 

技术流程

INZR-LM (LM-PCR法)技术流程  

INZR-WGS（WGS法）技术流程

 

整合位点检测技术方案

1.INZR-LM (LM-PCR法)

注：慢病毒插入细胞比例需要高于10%，否则结果可能不理想

• 应用场景：CAR-T细胞安全性检测（药物申报）；基因治疗研究中使用的病毒性载体的安全性检测等；
• LM-PCR不适合评估每个整合位点插入序列发生的变异，不适用于插入序列的拷贝数检测，拷贝数检测可以采用qPCR方法进行。

2. INZR-WGS（WGS法）

• 应用场景：单克隆抗体药物辅助筛选；致癌性病毒整合位点检测与整合偏好性分析等；
• WGS不适用于转染之后未经过传代培养和表型筛选的细胞系。

 

丰富的项目经验

目前，金唯智已与国内外多家免疫治疗研究前沿企业开展合作，采用该方法对高度异质性的CAR-T细胞进行整合位点检测与细胞安全性评估，具有较为丰富的项目经验。早在2018年，金唯智协助客户完成HBV整合人基因组位点及重排检测实验，文章如图

一般 HBV 插入到基因组中形成下图结构。使用三代测序，靶向插入区域的测序reads 可分为 Reads group 1（HBV 插入区域测通）和 Reads group 2 （reads 部分比对染色体，部分比对 HBV 插入区域）。基于三代数据比对后bam文件的IGV图，判断变异类型，推断断点类型和插入序列。 使用脚本抓取 Reads group1类型reads，根据比对结果进行统计，计算染色体断点位置以及HBV 序列的断裂信息。

金唯智推出的整合位点分析服务采用LM-PCR和全基因组重测序两种方法，可以有效分析重组细胞外源序列的整合位点，充分评估插入突变的可能性和相关风险，保证重组细胞安全性，从而协助我们的客户顺利完成从课题研究到药品注册申报过程。

聚焦基因治疗，金唯智可以提供基因治疗几大主流工具：病毒基因组测序、慢病毒包装，腺病毒包装、腺相关病毒包装服务以及CRISPR基因编辑服务。同时我们可以为客户提供高质量的可用于细胞感染和动物实验的病毒服务。

上游金唯智推出AAV-ITR测序方法，能够有效评估AAV质粒中ITR区域的完整性，迅速准确地检测到ITR区域的突变，为后续故障的排除节省时间和精力。下游我们同期推出重组细胞整合位点服务、基因编辑脱靶检测服务，确保重组/编辑细胞安全性。