慢病毒（lentivirus , LV）是目前细胞及模式生物实验中非常有效的工具，在基因转染方面有着许多独特的优势，例如：对分裂细胞和非分裂细胞均能够有效感染，可容纳较大基因片段，同时能够将携带的基因稳定的整合到基因组中等优势。慢病毒包装也逐渐成为科研必备的实验技能之一，让我们从慢病毒的载体结构开始，详细了解一下吧！

慢病毒载体的来源

慢病毒属（lentivirus）在分类上属于逆转录病毒科，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴和巨噬细胞为主，导致感染个体发病。慢病毒感染的主要临床特点是在出现典型的临床症状以前，经历较长的潜伏期，之后缓慢发病，因此被称为慢病毒。慢病毒通常与免疫系统和中枢神经系统的慢性疾病有关，如人类免疫缺陷病毒（HIV）会导致艾滋病。

图1 慢病毒的典型形态

慢病毒载体的结构

1）野生型HIV-1的基因结构
作为慢病毒载体的改造基础，我们首先了解一下野生型HIV-1的基因结构。HIV-1病毒基因组是由两条正链的RNA组成，长度约为9Kb左右，两端是长末端重复序列（LTR），两个LTR之间的序列为编码蛋白的序列，由9个基因所构成（图2）。

图2 野生型HIV-1的基因结构

9个基因按照编码的蛋白重要性不同，可以分成三类

◆  编码三种主要病毒结构蛋白的基因：gag、pol和env。gag基因编码病毒的核心蛋白如核衣壳蛋白、内膜蛋白和衣壳蛋白；pol基因编码病毒复制相关的酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白。

◆  编码两个调节蛋白的基因：tat、rev。rev主要参与蛋白调节的表达水平，tat参与蛋白转录的控制，与病毒的长末端重复序列（long terminalrepeats,LTRS）结合后促进病毒的所有基因的转录。

◆  编码四个辅助蛋白的基因：vif、vpr、vpu、nef。在HIV-1的基因组结构上，还含有病毒生命史所需要的其他序列结构，例如病毒复制和包装等所需要的信号等。

2）慢病毒载体

慢病毒载体则是以慢病毒基因组为基础，对慢病毒自身的元件，如LTR，Gag，Pol，Env等进行改造而发展起来的一类能够携带外源基因的病毒载体。

根据其来源主要有以下几种类型:HIV-1型( human immunodeficiency virus type1)载体系统, HIV-2型( human immunodeficiency virus type2)载体系统, 猿类免疫缺陷病毒( simian immunodeficiency virus,SIV) ,猫免疫缺陷病毒( felines immunodeficiency virus, FIV)等，其中HIV-1 型载体系统研究得最为广泛和深入。

慢病毒载体的发展过程

为了避免有复制能力病毒(RCV)的产生，在构建HIV-1型病毒载体时一般将HIV-1基因组分装于几个质粒载体中，再共转染细胞，然后获得只有一次感染能力而无复制能力的HIV-1载体颗粒。到目前为止，慢病毒载体的设计大约经历了以下几个阶段。

1）两质粒系统

以HIV-1为骨架，将其中的反式作用蛋白基因序列去除，然后包装成为含有目标基因的重组质粒和能够反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，共转染包装细胞（如293T细胞）进行包装。两质粒系统为复制缺陷型载体，仅能获得较低的滴度，且仅能感染CD4+的靶细胞，并存在产生野生型HIV的严重危险。

2）三质粒系统

将HIV-1基因组中负责包装，逆转录和整合所需要的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列分离，再克隆到三个独立的质粒中，并去除了所有的辅助序列。极大地增加了病毒的安全性，是目前比较常用的慢病毒包装系统。三质粒的结构如图3所示。

图3 三质粒HIV-1病毒包装系统

◆  包装质粒（Packaging plasmid）：含有CMV启动子，控制gag，pol，tat，rev基因的表达，编码部分结构蛋白和调节蛋白。

◆  包膜质粒（Envelope plasmid）：含有表达水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因的序列，这个基因用于代替原病毒的env基因，这个基因的产物，可以提高病毒的宿主范围。

◆  载体质粒（Transfer plasmid）：其中含有病毒LTR以及研究人员所感兴趣的基因序列结构。不过需要注意的是，载体质粒的表达依赖包装质粒中tat基因的启动。

4）四质粒系统

四系统是在三质粒系统的基础上改进而来的，也是目前较为常用的病毒系统。与三质粒系统相比，第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上，新增一个质粒更增加了系统的安全性。第二个变化是将tat基因去除，并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5’LTR，以启动载体质粒的表达。这样就形成了四个质粒的系统，即pGag/Pol、pRev、pVSV-G。此外，还有一个可以放置目的基因序列的载体。这个体系意外产生活性病毒的可能被大大降低。四质粒的结构如图4所示。

图4 四质粒HIV-1病毒包装系统

  金唯智可以为客户提供三质粒及四质粒系统的慢病毒包装。

慢病毒载体的应用

与其他逆转录病毒相比，慢病毒有其独特的优点：

◆ 有更广泛的宿主，对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，使目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加。

◆  稳定表达。慢病毒可以将外源基因有效的整合到细胞染色体中，且目的基因对转录沉默作用有一定的抵抗能力，可以在靶细胞中得到持续高效稳定的表达。

◆  经过构建后的慢病毒载体可以携带大约5kb，甚至更长的目的基因。因此除了外源的short-hairpin RNAs（shRNAs）等小分子外，很多cDNA也能被克隆进入慢病毒载体，当然随着目的基因长度的增加，其病毒滴度也会随之下降。

基于慢病毒的优点，可以利用慢病毒载体系统进行转染目的基因或RNAi基因的常规实验操作，同时慢病毒在基因编辑、基因治疗、转基因动物、药物研究等领域也发挥着重要作用。



参考文献：
Altering the tropism oflentiviral vectors through pseudotyping. Cronin J, Zhang XY, Reiser J. Curr Gene Ther. 2005. 5(4): 387-398.
HIV-1 Genome Nuclear ImportIs Mediated by a Central DNA Flap. Zennou V, Petit C, Guetard D, Nerhbass U,Montagnier L, Charneau P. Cell. 2000. 101(2): 173-185.
A Third Generation LentivirusVector with a Conditional Packaging System. Dull T, Zufferey R, Kelly M, MandelRJ, Nguyen M, Trono D, and Naldini L. J Virol. 1998. 72(11):8463-8471.
孟凡荣, 陈琛, 万海粟, et al. 慢病毒载体及其研究进展[J]. 中国肺癌杂志, 2014(12):870-876.