腺相关病毒(AAV)是目前基因治疗领域的“明星”载体，然而由于其自身结构的特点，使得对AAV载体的研究具有一定的挑战。AAV基因组的两端包含两个145bp的反向末端重复序列(ITR)，这会形成一种高度稳定的T型发夹结构，它在病毒的复制和包装过程中起到了关键的作用。然而这种特殊结构对于AAV质粒生产和QC过程产生了不小的挑战。

AAV载体包装的过程

不稳定的ITR 

众所周知，AAV质粒中的 ITR 区域并不稳定，它的回文序列和高GC含量使得它们在细菌繁殖过程中容易突变或丢失。这种突变由于少了复杂发夹结构的影响，反而可以更快速的复制，使得其宿主菌取得生长优势。通常即使用了最标准的实验方法，制备出来的AAV质粒也可能含有5%-15%的突变。由于ITR在AAV病毒复制和包装过程中起到关键作用，ITR缺陷或缺失会导致病毒包装效率降低，也严重影响下游实验。

AAV质粒的ITR区域表现出高度的不稳定性 

困难重重的ITR检测

鉴于ITR突变的频率，在病毒包装之前，检测评估质粒中ITR区域的完整性就变得至关重要。

普通Sanger测序法

常规的Sanger测序无法准确地读取ITR区域，ITR的二级结构会阻碍DNA聚合酶，导致信号中断，测序失败。即使是采用常见的困难模板测序方案也是无效的，例如添加DMSO或甜菜碱。

常规的Sanger测序色谱图显示，从ITR区域开始信号中断，测序过早中止 

常规酶切验证法

常规方法采用限制性内切酶SmaI来验证ITR区域的完整性，但当缺失片段很小时，靠着凝胶电泳是无法区分的。 

酶切法不能检测到ITR区域的小片段丢失。(A)AAV质粒限制酶酶切位点图。(B)SmaI酶切后的凝胶电泳图显示条带大小与预期一致。(C)通过Azenta 的 AAV-ITR 测序发现该质粒的ITR区域的BB’ 臂已丢失，然而依靠琼脂糖凝胶电泳却无法分辨这种22 bp的丢失。 

 

如何解决ITR突变带来的困扰呢?

1、Azenta重组菌株提高ITR区域完整性
通常认为，采用重组缺陷菌株(例如JC8111、SURE2、Stabl3、XL10-Gold)克隆AAV质粒可以降低ITR缺失的频率。但在实际研究中发现，对于特定的构建体，使用RecA缺陷型的商业菌株，也很难获得完整的ITR区域。为了克服这一难点，Azenta Life Sciences专门开发了可以改善 ITR 区域完整性的重组菌株。我们选择了8种不同的AAV质粒进行了测试，下图的结果表明，Azenta重组菌株的优势更明显，可以保证ITR区域的完整性。
如果实验中选择一般的商用菌株，就需要投入更多的精力去筛选大量的菌株来获得一个完整的克隆。此外，在扩增的过程中，发生突变的可能性会变大，得到的质粒也会影响到下游实验。

 

 

不同菌株中ITR区域的完整性(A)针对5种菌株，测试了8个不同的AAV质粒。转化后，每株的每个质粒挑选8个菌落，并使用来自Azenta Life Sciences 的AAV-ITR测序检测ITR的完整性。(B)8种AAV质粒的ITR完整性的综合结果。(C)ITR稳定性最低的3 个质粒的结果。 

2、Azenta准确灵敏的ITR测序服务
前面讲过，常规的Sanger测序无法准确验证ITR序列，对评估AAV质粒的质量造成了一定的困扰。Azenta Life Sciences 开发了一种原创的Sanger测序方案，可以清晰地分析读取ITR区域，帮助研发人员有效地评估ITR区域的完整性。

常规测序

 

Azenta AAV-ITR测序

 细菌扩增过程中，AAV质粒最常见的突变之一是ITR的B-B`或C-C`臂缺失。这种缺失使得T型ITR发夹的茎更长，比野生型的ITR更加稳定，也更难测通。安升达在对来自不同细菌中扩增的数百条AAV质粒进行测序后，我们发现Azenta新型AAV-ITR测序方法可以稳定测通野生型与缺失突变的ITR序列。

采用Azenta的AAV-ITR测序方案检测ITR区域。(A) 野生型AAV2的ITR序列的示意图和色谱图。CC’臂和 BB’臂分别用红色和蓝色下划线标出。(B)包含BB’ 臂缺失的突变AAV2 的ITR序列的示意图和色谱图。(C)野生型与ITR缺失的突变型混合质粒的色谱图，从145bp开始出现套峰。Azenta的ITR测序方法可以检测野生型和突变型ITR序列，无显著偏差。

总结

为什么要进行AAV-ITR测序?

1、ITR区域不稳定，在质粒扩增过程中容易缺失；
2、ITR缺陷或缺失会导致病毒包装效率降低；
3、尽早、经常QC确保ITR区域的完成度。

 

常规测序 VS 安升达AAV-ITR测序