案例解析

中文题目：转录因子six2通过促进假基因CYP4Z2P与功能基因CYP4Z1之间的ceRNA网络促进乳腺癌细胞干性
英文题目：Transcriptionalfactor six2 promotes the competitive endogenous RNA network between CYP4Z1 andpseudogene CYP4Z2P responsible for maintaining the stemness of breast cancercells
关键词：转录因子six2、假基因、ceRNET_CC、乳腺癌细胞干性
发表期刊：JHematol Oncol
阅读时间：10min
网站信息：
https://link.springer.com/article/10.1186/s13045-019-0697-6
一、研究背景  

耐药性是阿霉素治疗乳腺癌面临的主要难题。研究表明阿霉素耐药过程是由多基因共同完成的，且肿瘤干细胞是造成肿瘤耐药的主要原因。

研究者发现CYP4Z1及其假基因CYPZ2P均在乳腺癌中高表达，且它们通过假基因CYP4Z2P介导的竞争性内源RNA（ceRNA）网络促进乳腺癌血管生成及肿瘤干细胞样特性；组织芯片分析发现转录因子six2也在乳腺癌中高表达，且six2可促进CYP4Z2P及CYP4Z1的表达。由此研究者设想：Six2可通过增强CYP4Z2P介导的ceRNA网络发生促进乳腺癌肿瘤干细胞样特性，导致乳腺癌对阿霉素产生耐药。
为此，本文以肿瘤干细胞为研究切入点，结合阿霉素耐药的乳腺癌细胞和动物模型，利用反向遗传学手段，研究six2参与调控的、假基因CYP4Z2P介导的ceRNA网络对阿霉素耐药性的调控作用，从新的视角阐明阿霉素耐药的机制，为临床阿霉素耐药的发生提供新的理论依据。
二、文章亮点  

本文通过ChIP-Seq首次在乳腺癌细胞中确证转录因子six2的结合位点，及其在CYP4Z1及其假基因CYP4Z2P启动子上的结合位点，并证实了six2调控的假基因CYP4Z2P 介导的ceRNA 网络与乳腺癌 CSCs 样特性相关性，更为有效直观观察six2 调控的假基因 CYP4Z2P 介导的ceRNA 网络与乳腺癌形成的相关性；
确证了CYP4Z1及其假基因CYP4Z2P之间的ceRNA网络在转录水平被调控的机制，为进一步确定six2调控的假基因CYP4Z2P 介导的ceRNA 网络为乳腺癌潜在靶标提供坚实的理论基础。

三、名词解释  

ceRNET_CC：功能基因CYP4Z1 和其假基因CYP4Z2P形成的竞争内源性RNA网络
ChIP：染色质免疫共沉淀
CSCs：肿瘤干细胞

四、技术流程  

五、研究结果（部分） 

1. 确认基因CYP4Z1和假基因CYP4Z2P的生物学功能
a．in vitro-转录组测序结合临床数据揭示ceRNET_CC促进乳腺癌细胞的干性
研究者通过线上临床数据发现相较于癌旁组织，肿瘤组织中CYP4Z1和CYP4Z2P的转录本丰度显著升高（如图1. a , b），且患者CYP4Z1的表达量和OS负相关（如图1. c）。对分别过表达CYP4Z1 3’UTR和CYP4Z2P 3’UTR的两个MCF-7细胞系进行转录组测序分析，结果显示：受CYP4Z1 3’UTR和CYP4Z2P 3’UTR调节的基因显著重叠（5530个）(如图1. d)，由CYP4Z1 3’UTR和CYP4Z2P 3’UTR激活/抑制的差异表达基因数目相似(3404 vs.3934)( 如图1. e , f)。通过GSEA分析和功能注释分析，结果发现MCF-7-Z2P-UTR 和 MCF-Z1-UTR 细胞系的干细胞特征富集(图1. g–i)，激活了调节细胞多能干细胞性的信号通路(图1. j)，在差异表达的基因中，研究者鉴定了一组与上皮性癌干细胞相关的基因标记(图1. j)。

图1.CeRNET_CC 促进乳腺癌细胞干性       

b．in vivo—小鼠成瘤实验ceRNET_CC促进乳腺癌细胞的肿瘤启动潜能
MCF-7细胞系、分别过表达/敲低了CYP4Z1 3’UTR和CYP4Z2P 3’UTR的MCF-7细胞等5个细胞系做小鼠成瘤实验。其中过表达CYP4Z1 3’UTR和CYP4Z2P 3’UTR的MCF-7细胞系，显著增加肿瘤的大小和数量，敲低基因的细胞系降低了肿瘤启动活性(图2. a–f)。在MDA-MB-231 细胞中敲低基因后同样观察到肿瘤启动活性显著减少(图2. g–k)。

图2. CeRNET_CC促进乳腺癌细胞的肿瘤启动潜能

2. 信号通路分析—ceRNET_CC部分通过hTERT/PI3K/Akt和 ERK1/2 信号通路促进乳腺癌细胞干性
为了探索ceRNET_CC促进乳腺癌细胞干性的分子通路机制，我们对CYP4Z1- /CYP4Z2P-3′UTRvs MCF-2的差异表达基因进行通路富集分析，结果显示过表达基因后，磷脂酰肌醇信号和MAPK信号通路显著上调(图3. a, f)。作者之前的研究支持这一信号通路富集结果，ceRNET_CC促进hTERT表达，激活hTERT/PI3K/Akt和 ERK1/2 信号通路。
MCF-7-Z1-UTRor MCF-7-Z2P-UTR 细胞系中敲减hTERT或者用PI3K抑制剂（ly294002）、ERK1/2 通路抑制剂 (VX-11e)，然后进行细胞成球实验、检测CD44+/CD24+细胞群数量。如图3.c，d所示，sihTERT转染或者通路抑制剂处理后的细胞成球能力减弱、CD44+/CD24+细胞群数量减少，WB实验结果显示干性标志物 ALDH1 和 OCT3/4减少，p-Akt andp-ERK1/2 表达水平降低。
这些结果表明ceRNET_CC以hTERT/PI3K/Akt 和 ERK1/2 信号通路依赖的方式促进乳腺癌细胞干性。

图3. ceRNET_CC部分通过hTERT/PI3K/Akt和ERK1/2 信号通路促进乳腺癌细胞干性

3.  上游分子机制研究——转录因子six2
a. 转录因子six2结合到CYP4Z1和CYP4Z2P的启动子区域增强其表达

首先，利用线上软件the Genomatix Software Suite v3.10 (https://www.genomatix.de)预测可以结合在基因和假基因启动子区域的转录因子，其中转录因子six2引起了研究者的注意，因为它已经被证明能促进乳腺癌转移并在肾发生过程中调节肾单位祖细胞池的扩张，这涉及到一个类似于CSC形成的过程；然后，通过慢病毒转染构建过表达six2的MCF-2的细胞系，利用抗six2抗体进行全基因组范围内染色质免疫共沉淀测序分析来确认转录因子six2结合的染色质结合区域。

ChIP-seq结果显示， Peaks主要位于启动子区域或者转录起始位置（如图4.a），从分析结果可以看到转录因子six2占据CYP4Z1和CYP4Z2P的启动子区域（如图4.b），motif分析发现了5′-TCAG-3′这一基序（如图4.c）。研究者构建CYP4Z1和CYP4Z2P靶启动子不同区域的荧光素酶报告基因质粒，一系列实验结果表明，转录因子six2可以直接结合到CYP4Z1和CYP4Z2P启动子区域的5′-TCAG-3′序列区域（结果展示见原文章补充数据文件9）。临床乳腺癌组织样本的qPCR分析发现，six2和CYP4Z1、six2和CYP4Z2P的表达呈正相关性（如图4.d）。
研究者一系列的结果表明，转录因子six2直接结合到CYP4Z1和CYP4Z2P的启动子区域增强其表达、激活ceRNET_CC。

图4. 转录因子 six2 调节基因CYP4Z1和假基因CYP4Z2P.的转录

b. 转录因子six2的生物学功能—促进乳腺癌细胞干性
对过表达six2的MCF-six2细胞系进行转录组测序，联合如前所述数据联合分析发现：受CYP4Z1、CYP4Z2P和six2调节的基因显著重叠且正相关 (如图5. a, b)。通过线上数据(图5.c)和肿瘤组织微阵列的免疫组化实验(图5.d)结果表明乳腺癌组织中six2的表达显著增加。GSEA基因集富集分析显示six2的过度表达导致了与胚胎干细胞和乳腺干细胞功能相关的基因集的富集（图5. f, g）。
MCF-7 细胞系、分别过表达/敲低six2的MCF-7细胞等3个细胞系做小鼠成瘤实验。其中过表达six2的MCF-7细胞系显著增加了肿瘤的大小和数量，敲低基因的细胞系减少了肿瘤数量和大小（图6. a–d)。在MDA-MB-231 细胞中敲低基因后同样观察到肿瘤启动活性显著减少(图6. e–i)。

 4. ceRNET_CC是转录因子six2诱导效应的充分必要条件
研究者进一步探索转录因子促进乳腺癌细胞干性的能力是否依赖于ceRNET_CC。过表达six2的细胞中siRNA干扰CYP4Z1、CYP4Z2P的表达，细胞成球量降低，CD44+/CD24−细胞群数量减少、hTERT、p-Akt和p-ERK1/2 表达量降低（图7.a–e）。
过表达six2的细胞中敲减CYP4Z1、CYP4Z2P，命名此细胞株为MCF-7-six2-si-Z1和 MCF-7-six2-si-Z2P，敲减six2的细胞中过表达CYP4Z1 3’UTR、CYP4Z2P 3’UTR，命名此细胞株为MCF-7-Plko-six2-Z1-UTR 和 MCF-7-Plko-six2-Z2P-UTR。如图7肿瘤成瘤实验显示，过表达six2增加MCF-7细胞的成瘤能力，敲减CYP4Z1、CYP4Z2P后其成瘤能力受到抑制；敲减six2降低MCF-7细胞成瘤能力，但过表达CYP4Z1 3’UTR、CYP4Z2P 3’UTR可恢复MCF-7细胞的成瘤能力。

图7. ceRNET_CC是转录因子six2诱导效应的充分必要条件

5. Six2介导的CERNET-CC调控通过促进细胞干性使乳腺癌细胞对阿霉素产生耐药性
研究者建立的six2/ ceRNET_CC轴有促进乳腺癌细胞CSC特性的能力。已有文章证实赋予CSC特性赋予肿瘤细胞耐药性，作者推测此调节轴可能通过促进细胞干性降低乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。
首先检测MCF-7和阿霉素耐药的MCF-7（MCF-7-Adr）细胞中six2、CYP4Z1和假基因CYP4Z1的表达，qPCR结果表明，MCF-7-Adr细胞中，six2、CYP4Z1和假基因CYP4Z1的表达显著增加（图8.a）MCF-7-Adr 细胞表现出较高的P-gp（一种多药耐药蛋白）和多能干转录因子的表达以及PI3K/AKT和ERK1/2信号的过度激活，敲除CYP4Z1-/CYP4Z1-3′UTR或six2减弱这两种信号表达，而过表达CYP4Z1 3’UTR或CYP4Z2P 3′UTR可恢复因敲减six2引起的信号减弱（如图8. b）。此外，敲除CYP4Z1- / CYP4Z1-3′UTR或six2降低了MCF-7-Adr细胞的成球能力（图8. c）和CD44+/CD24−细胞群数量（图8. d），降低了MCF-7-Adr细胞的肿瘤成瘤潜能（图8. e和f）
因此，本文的研究结果表明，six2/ ceRNET_CC调节轴通过促进乳腺癌细胞的干性来降低阿霉素的敏感性。

图8. Six2介导的CERNET-CC调控通过促进细胞干度使乳腺癌细胞对阿霉素治疗产生耐药性

六、文章结论  
转录因子six2可通过结合于假基因CYP4Z2P及功能基因CYP4Z1的启动子5′-TCAG-3′位点，促进CYP4Z2P及CYP4Z1的表达，激活CYP4Z1及其假基因CYP4Z2P之间的ceRNA网络，促进乳腺癌细胞干性，导致阿霉素耐药。(补充文件14：图8)。

致谢：
本文研究背景、亮点及文章结论部分皆由文献第一作者郑博士提供，并对全文提出宝贵修改意见，在此郑重表示感谢。

声明：
因篇幅有限，仅列举部分结果，如需查看原文献获取更多信息，可点击文末“阅读原文”。欢迎广大读者留言，共同探讨文章。