基因组编辑技术CRISPR/Cas9自2013年被《科学》杂志列为年度十大科技进展之一以来，受到越来越多的科研工作者的高度重视，成为基因敲除和基因敲入的主要研究手段。

针对模式生物和细胞中进行基因序列替换、外显子突变位点修复和融合标签等大片段的敲入等方面，现在普遍面临着dsDNA片段的随机插入和片段敲入效率低等风险，难以在精准的基因编辑上被广泛应用。相比之下，Long ssDNA，因其片段敲入效率高、能有效避免dsDNA片段在基因组中随机插入的问题等优势脱颖而出。

那么Long ssDNA的编辑效率到底如何? Long ssDNA是否真的可以有效降低随机整合的问题?在长度上，又该怎么选择Long ssDNA呢?今天就这些问题，小编带您领略Long ssDNA在模式动物构建和细胞编辑中的非凡功力。

案例分析(一)

Long ssDNA在小鼠模型构建中的应用

Fig.1 Fusion of P2A-FlpO to the 3′end of Fgf8 using Easi-CRISPR

小鼠由于易获得、生长周期短和易操作等优点而被广泛用于人类疾病的建模。研究表明在构建模式小鼠中以Long ssDNA作为“Donor template”时，片段敲入效率达到8.5-100%[1]，极大的缩短了建模周期。作者将体外转录合成的crRNA、tracrRNA与Cas9蛋白结合形成RNP复合物和大小为0.8-1.5kb且同源臂长度为60-105nt的ssDNA(P2A-FlpO)同时注射进小鼠受精卵。随后分别对G0代小鼠中Fgf8等6个基因插入位点靶区域进行扩增测序，结果表明Long ssDNA(P2A-FlpO)作为修复模板在小鼠模型中的敲入效率约为25%-67%。

案例分析(二)

ssDNA 或dsDNA “Donor template”的选择

为了研究不同类型的Donor 片段的敲入效率和特异性，作者使用同源臂长度均为150 nt且包含GFP序列的ssDNA、质粒和PCR片段靶向HEK293T细胞中的RAB11A 和CLTA位点，通过检测携带GFP的细胞来区分片段敲入效率的高低。 

Fig.2 Comparison between ssDNA, plasmid and PCR donors

研究表明：3种类型的Donor片段敲入效率为PCR片段>ssDNA>质粒;但是进一步的特异性分析表明： ssDNA 表现出更高的特异性，质粒模板较低，PCR产物的特异性最差：在RAB11A 和CLTA位点仅表现出约20-30%特异性，推测可能是由于PCR片段在基因组其他位置出现随机整合。因此， ssDNA无疑是片段敲入实验中最适宜的 “Donor template”。同时作者研究表明在细胞中ssDNA能提高敲入效率到20-40%[2]，更易筛选获得片段敲入的突变体。

案例分析(三)

Long ssDNA同源臂长度和用量对敲入效率的影响

文章中作者通过使用同源臂长度分别为36 nt、72 nt、150 nt、400 nt和700 nt的ssDNA在RAB11A和SEC61B中敲入携带GFP的片段来比较不同长度同源臂片段的敲入效率。 

Fig.3 Optimization of ssDNA donor design

研究表明：在一定范围内，随着ssDNA同源臂长度的增加敲入效率显著上升。当同源臂长度为300-400 nt,修复模板量为20 pmol / 2e5 cells时，其在HEK293T细胞中敲入效率达到最大值的95%，在悬浮细胞株K562中观察到同样的结果。因此，在进行片段敲入实验时，同源臂长度为 400-700 nt、修复模板量为20 pmol / 2e5 cells的ssDNA是好的选择。

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参考文献:

[1] Quadros, R.M. et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biol. DOI 10.1186/s13059-017-1220-4.

[2] Li, H，et al. Design and specificity of long ssDNA donors for CRISPR-based knock-in. BioRxiv，Doi https://doi.org/10.1101/178905 .