基因的功能研究一直是生物学研究的核心，建立合适的遗传筛选体系，是基因功能研究的最佳手段。最早的辐射和化学诱变就是经典的正向遗传学方法，基于表型筛选出基因组上的随机突变，寻找表型和基因的联系。基因诱变法在生物学研究的初期帮助我们解析了很多基因的功能，但是表型筛选的工作量巨大，还需要进行繁琐的杂交实验来确定基因位置和序列，在生物学研究逐步进入基因组学时代后，正向遗传学方法逐渐被淘汰。

相比于正向遗传学方法，反向遗传学方法更为直接，基于确定的基因序列筛选相应的表型。生物研究中最常用的反向遗传学筛选方法是cDNA表达文库和shRNA文库，分别利用基因的过表达和敲低进行表型筛选。人工构建的全基因cDNA表达文库成本很高，而shRNA由于RNAi技术天生的缺陷，经常出现假阳性等异常结果，导致筛选出错误基因。

而CRISPR技术的出现，给予研究者在DNA序列上操控基因的能力。相比于前几代的基因编辑技术，CRISPR最大的优势是构建成本极低，在靶向不同的基因时，只需要改变sgRNA的5’端20个碱基，以目前的核酸芯片合成技术，可以同时合成上百万条sgRNA序列，构建覆盖全基因的sgRNA文库。

CRISPR-Screen简介：

CRISPR-Screen又称全基因组CRISPR，或者高通量基因编辑技术，是一种由张锋团队开发的，基于CRISPR-Cas9系统，通过构建sgRNA敲除文库同时对多个活性细胞的不同基因进行基因敲除，辅助以特定的筛选方案，通过NGS测序和生信分析的手段，预测出符合条件的候选基因。

CRISPR-SCREEN筛选详细流程：

进行CRISPR-SCREEN需要经过多个流程，详细的实验流程见图一

图一：CRISPR-Screen全流程总览

如何对全基因组或者部分基因组序列sgRNA文库序列设计呢？

要想用好CRISPR-SCREEN技术，sgRNA文库的设计是非常重要的，设计的sgRNA既要编辑效率高，又要脱靶低，还要敲除后能保证基因发生移码突变，所以我们需要综合考虑多种条件，其中最重要的几个条件如下：

• GC含量分析；
• 切割位置选择；
• 序列二级结构分析；
• gRNA特异性分析；
• 设计的gRNA序列（除PAM）避免出现4个或者以上的T在靶序列中；
• gRNA序列预测的efficient score；
• gRNA序列潜在的拖把或者错配数；

高质量的sgRNA是结论准确的重要保证，那么如何构建高质量的sgRNA文库的呢？

首先，合成sgRNA文库芯片的正确率和覆盖度极其重要。例如：以长度为100 nt的sgRNA为例子，若5‰平均突变率（为行业突变率均值），则sgRNA文库中完全正确的sgRNA数在总sgRNA的比例为：（0.995）^100=60.6%；若1‰平均突变率（安升达美国oligo pool的平均突变率），则sgRNA文库中完全正确oligo数在总sgRNA的比例为：（0.999）^100=90.5%；而引物的覆盖度影响：如果以人全基因组文库12万条为例，如果覆盖度为99%，则会丢失120条sgRNA;那么这丢失的120条sgRNA在后续结果分析中就会对分析结果造成干扰;由此可见芯片合成的质粒对后续文库质粒的影响有多大。

其次，文库的深度对于下游筛选中低频sgRNA丢失影响巨大。sgRNA合成过程中，由于sgRNA合成规模大，sgRNA的分布符合泊松分布的，一定会有一些sgRNA是低频的，因此在文库构建过程中，一定要保证文库具有足够的深度才能防止低频sgRNA的丢失：菌落总数至少是sgRNA总条数的300倍以上，才能保证低频sgRNA丢失率尽可能的低；

再次，要经过严格的NGS测序分析检测文库的覆盖度和均一性。覆盖度越接近100％，均一性越接近1，则代表文库的质量越高。所以在正式进行下游实验之前，一定要保证文库通过NGS质检并达到相应的质量标准。

大量的文库慢病毒制备以及Cas9稳定表达细胞系的构建有哪些注意事项呢？

预估正式实验中所需要的慢病毒总量：根据sgRNA文库的总条数，以及目的细胞系的慢病毒侵染MOI值，平行实验的数目，项目验证的时间节点的具体方案等具体的实验涉及，来计算大规模实验中所需要的慢病毒总量，然后准备实验中需要用到的足够量的病毒，为了保证实验结果的准确性，建议整个流程中需要用到的文库病毒来源于同一个批次，所以CRISPR-Screen实验中经常需要准备大量的慢病毒。

如果研究者使用的是双质粒系统，高表达Cas9的稳转细胞系也是后续细胞筛选实验及最终结果准确的重要保证之一；构建的Cas9稳定表达细胞系也需要通过基因组水平，mRNA水平（qPCR检测），蛋白水平（WB检测）以及功能验证（基因编辑效率验证）等多个水平的检测确保用于后续筛选实验的Cas9稳转株具有相对较高的编辑效率。

大规模细胞筛选时又有哪些注意事项呢？

CRISPR-SCREEN技术的核心就是大规模的筛选，理论上来说，越大的细胞pool筛选库得出的结论越接近真是情况；然而实际实验操作过程中，考虑到实验方案的可操作性，不可能无限制的增加筛选库，即使这样，为了包装结果的可信度，我们仍然对于实验参数设计有最低的限制。

首先，病毒侵染细胞时，单个细胞进入的病毒数目超过2个，则可能导致结果出现较差影响，因此最理想的状况是细胞中进入的病毒数量不超过1个，所以在病毒侵染细胞的过程中，加入病毒/细胞的比例越低越好，然而比例越低同样会使实验规模成倍的增加，所以，为了保证结果的准确性，加入病毒量的MOI值在0.3~0.5之间才能保证结果的准确度；如果文库较小可以适当降低MOI值，则会使结果更加准确。

其次，要设计好实验方案，确定最合适的阴性对照组，同时一般建议做2-3个平行实验组，以确保后续结果分析的准确性和实验的可重复性。

第三，每一步实验都必须要保证足够的库容量来保证低频sgRNA在整个实验过程中尽量不因为库容量低导致的丢失，那么在筛选过程中，首先要保证大规模实验过程中初始被病毒成功侵染的细胞是sgRNA总数目的300倍以上；同时最终进行NGS建库过程中，也要保证使用足量的基因组DNA建库和足够的测序深度（300x以上）来保证整个数据的准确性。

第四，得到NGS数据以后，可以根据自身研究目的，可以对数据从多个方向进行分析，充分发掘尽可能多的结论。

文献推荐：

为了让大家看看在各自研究方向，杰出科学家是如何利用CRISPR-SCREEN进行相关领域的研究，小编针对非常适合用CRISPR-SCREEN的几个研究领域，给大家推荐一些非常经典的研究文献供大家更有针对性的参考。

药物靶点确定与验证：

研究人员利用CRISPR-Cas9文库筛选人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选，最终发现NF2、CUL3等4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。

文献题目：Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells

基因环路上下游调控机制分析：

科研人员利用CRISPR-Cas9文库对癌症细胞中关键的转录因子p53和ERα的增强子元件的685个基因位点进行筛查。通过CRISPR-Cas9文库筛选，共鉴定出3个增强元件与ERα的相关；3个增强元件与p53功能相关联的3个增强子，其中2个增强元件与p53完全结合才能激活细胞衰老过程。

文献题目：Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9

代谢通路调节机制分析：

科研人员选择对番茄植株GABA代谢通路中多个关键基因进行基因编辑，筛选得到六种GABA突变体，其中四基因突变的GABA-6突变体叶子GABA含量与WT相比提高了19倍，这为CRISPR-Cas9多靶点敲除技术在植株代谢调控中的应用研究提供了参考。

文献题目：Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum

Long noncoding RNA作用机制分析：

使用慢病毒psgRNA文库，对人源肝癌细胞系Huh7.5OC进行基因组的700个lncRNA和另外5种癌症细胞进行敲除实验，最终筛选到51个lncRNA基因能够促进或者抑制肿瘤的生长。

文献题目：Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library

病毒侵染宿主细胞的受体蛋白筛选：

科学家通过CRISPR全基因组筛选，成功发现并证实LDLRAD3蛋白是委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）进入动物和人类细胞的受体[8]；以及上期小编专门进行过的文献解读的一篇利用CRISPR全基因组筛选出冠状病毒侵入宿主细胞的受体蛋白以及与新冠病毒相关正相关和负相关的重要基因。

文献题目：LDLRAD3 is a receptor for Venezuelan equine encephalitis virus

高通量基因编辑一站式解决方案

安升达具有全基因组sgRNA设计平台、全基因组sgRNA合成平台、慢病毒包装及稳转细胞系构建平台及高通量测序+筛选分析平台，同时具有Broad实验室专利授权，可提供人和小鼠全基因组敲除文库的现货文库及其他定制化文库，满足不同研究用途的需求。安升达高通量基因编辑一站式解决方案，助力解决CRISPR-CREEN任何环节的痛难点。

安升达现货文库信息

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参考文献：

[1] Konermann, Silvana, et al. “Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.” Nature 517.7536 (2015): 583-588.

[2] Wei, Jin, et al. “Genome-wide CRISPR screens reveal host factors critical for SARS-CoV-2 infection.” Cell (2020).

[3] Hartenian E, Doench J G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology[J]. Febs Journal, 2015, 282(8):1383-1393.

[4] Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7

[5] Korkmaz, G., et al., Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 192-8.

[6] Li, R., et al., Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum. Plant Biotechnol J, 2017

[7] Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol, 2016.34(12): p. 1279-1286.

[8] Ma, Hongming, et al. “LDLRAD3 is a receptor for Venezuelan equine encephalitis virus.” Nature (2020): 1-7.