mRNA黄金十年，poly(A)标准品保驾护航

 

mRNA历史与展望

自1961年信使RNA（mRNA）首次被发现以来，各种临床应用不断拓展。递送技术与修饰技术的不断成熟，也推动了mRNA技术相关研究的加速发展。2020年新冠疫情爆发，以体外合成RNA为原料的mRNA疫苗，凭借其安全有效、易合成生产、能快速应对突变毒株等优点，受到全球广泛的关注。两款mRNA疫苗的上市也宣告mRNA技术正式进入商业化时代。

mRNA因其技术优势可广泛应用于预防疫苗、治疗疫苗、治疗药物等诸多领域，是一种极具潜力的通用技术平台。目前mRNA可应用于传染病预防、肿瘤免疫治疗、蛋白替代、CAR-T、基因编辑等。从传染病领域再到非传染病领域，如慢性疾病、肿瘤、心血管疾病等，mRNA都展示了强大的应用潜力。因此，众多生物制药公司纷纷投入大量人力物力进行mRNA药物的研发，推动了mRNA领域研究快速发展，mRNA有望进入快速发展的黄金十年。

根据PubMed预计，2035年mRNA市场总体规模230亿美金，其中非新冠产品有望达到180亿美金。

mRNA结构

典型的mRNA包含以下结构：5′-cap（5’端帽子）、5′-UTR（5’端非编码区）、 CDS（编码区）、3′-UTR（3’端非编码区）以及3’端poly(A)结构等。

  • 5′-cap（5’端帽子）：在真核生物中可以与翻译起始因子eIF4E结合，保持mRNA的稳定，提高翻译效率，同时抑制核酸外切酶对mRNA的降解并抑制固有免疫反应。
  • 5′-UTR（5’端非编码区）：调控翻译和蛋白表达，对mRNA的翻译效率、半衰期、蛋白表达水平等有影响。
  • CDS（编码区）：CDS在核糖体和tRNA等的作用下翻译形成肽链，肽链经折叠后形成蛋白质。通过密码子的优化、核苷酸替换等可增强mRNA的稳定性和翻译效率，同时减少固有免疫反应和mRNA的降解。
  • 3′-UTR（3’端非编码区）：调控翻译和蛋白表达，对mRNA的翻译效率、半衰期、蛋白表达水平等有影响。
  • 3′端poly(A)结构：在真核生物中，大多数mRNA分子在3’末端被多聚腺苷酸化，形成的poly(A)尾巴和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被核酸外切酶降解。3’端加尾对于转录终止，从细胞核输出mRNA和翻译也很重要。

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图1 mRNA结构示意

真核生物细胞中，3’端poly(A)连同5’端帽子结构被认为是调控mRNA翻译效率和细胞内稳定性的重要因素。这里我们着重看一下poly(A)结构。

poly(A)及其长度对于mRNA的重要性

poly(A)在细胞内的主要代谢过程及作用机制如下：细胞核中，前体mRNA被转录后，poly(A)聚合酶介导poly(A)的合成，其长度受到核poly(A)结合蛋白（PABPN）的调控。成熟的mRNA会被运输至细胞质，此时胞质poly(A)结合蛋白（PABPC）会与poly(A)结合，并与5’端帽子及其结合蛋白共同招募核糖体40S亚基。在起始密码子处，40S亚基与60S亚基结合，形成80S核糖体并开启蛋白质翻译。此外，poly(A)及PABPC共同影响细胞质中mRNA的稳定性，poly(A)序列的降解会导致PABPC蛋白的释放，并最终导致mRNA降解[1]。

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图片来源：[1]

poly(A)长度被发现和mRNA的翻译与稳定性密切相关[2]。早期人们认为，poly(A)越长越能保护mRNA不被降解，但随着研究的深入，特别是针对poly(A)的测序技术发展，人们发现真相可能不像想象中那样简单。

一些研究表明，相对较短的poly(A)通常出现在高表达的、翻译效率较高mRNA中，而较长的poly(A)则更多出现地在低丰度的、翻译效率较低的mRNA中。同时，poly(A)长度似乎与其在胞内的半衰期呈负相关。

mRNA药物，在体外制备mRNA时，通常会采用两种方法将poly(A)添加到RNA 3’端：

  1. 在体外转录模板上设计固定长度的poly(A)序列，通过体外转录直接添加；
  2. 在转录完成后用poly(A)聚合酶添加。

由于两种方法所用酶的特性，RNA产物中poly(A)的长度不可避免地会出现参差不齐的情况。鉴于poly(A)长度对于mRNA药物的重要性，各国药监机构出台的mRNA药物指导原则中均规定需要对mRNA的poly(A)长度进行严格地检测。

常见的mRNA poly(A)长度检测方法包括基于LC-MS的方法、基于色谱的分析方法、基于二代测序的方法，以及新兴的基于三代测序的方法等（详见推文“体外转录mRNA序列表征新方法”）。在poly(A)长度检测中，一份长度固定、均一性高的poly(A)标准品至关重要。

安升达提供的高质量poly(A) RNA标准品，可广泛地与上述多种方法适配，为mRNA的poly(A)长度检测提供可靠的参考。

安升达poly(A) RNA标准品

基于poly(A)尾在mRNA中的重要性，以及poly(A) RNA标准品在mRNA药物申报中的重要参考作用，安升达采用化学方法合成了不同poly(A)长度（50-120nt）的RNA，并使用LC-MS进行验证。

LC结果如图3所示：

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图3 不同poly(A)长度RNA的LC图

随着链长逐渐增加，LC出峰单一，确认产品纯度符合要求。

选取其中120nt的poly(A)的质谱结果展示，如图4所示：

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图4 120nt的poly(A)质谱结果

目标分子量为39443.0，测量分子量为39446.7，目标分子量和测量分子量偏差值≤0.05%，确认合成的poly(A) RNA标准品的分子量和理论值高度一致，产品符合要求。

更多引物合成的问题，可以通过电话：400-8100-669 ext. 5或者邮件Support.Asia@azenta.com联系安升达。

参考资料：

[1] Lori A. Passmore and Jeff Coller, 2021, Nature Reviews Molecular Cell Biology

[2] Angela L. Nicholson and Amy E. Pasquinelli, 2019, Trends in Cell Biology