当一场传染性疾病开始蔓延，对于这场危机的制造者杀气腾腾的病毒，我们到底了解多少呢？在技术革新快速的当今社会，很难有哪项技术可以被称之为YYDS。近年来，NGS乘风破浪，在生物研究技术中脱颖而出，展现出了极大的优势。尤其是在疑难微生物、新型菌属的鉴定，特别是新型病原微生物的暴发流行监测方面，NGS具有快速、准确和高分辨率的特点，使其成为疫病病原微生物鉴定的有力工具。同时NGS技术破解病原菌基因组序列后还可以进一步研究其与免疫相关的基因，从而可以助力疫苗的开发。

本文所介绍的无乳链球菌是养殖淡水和海洋鱼类中最常见的疾病之一。下文以无乳链球菌的De novo测序为例，介绍利用NGS研究无乳链球菌基因组组成和毒力因子相关的信息，完善鱼类无乳链球菌病的研究资料，为开发一款减毒疫苗防治鱼类无乳链球菌病提供参考。

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背景介绍

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，GBS)是一种严重的病原体，可导致从水生动物到哺乳动物，包括人在内的多种宿主的严重人畜共患病。最先从患乳腺炎的牛中分离而得名，随后在各国孕产妇和新生儿中分离到，可引起新生儿早发和晚发型感染，也被发现于各种畜牧及水产鱼类的流行病中，因此受到广泛关注。在水产养殖领域，特别是罗非鱼养殖中，无乳链球菌给鱼养殖造成了巨大的经济损失。据估计，2011年在中国的损失为4000万美元。为了积极推广的渔业病害防治技术，我国成立了水产疫苗研发基地——上海海洋动物疫苗工程技术研究中心。该中心的核心工作是突破主要水产健康养殖和疫病控制关键技术，创制高效特异性疫苗。它将引导中国的水产养殖业从“抗生素时代”跨入“疫苗时代”。在疫苗开发研究技术中，下一代测序(NGS)技术的出现，加上计算机能力的不断提高，使研究人员能够快速了解到病菌的基因组以及其它的基因组信息包括序列、毒力因子、基因数量、GC含量。

关于无乳链球菌目前已经开展了许多关于有效疫苗的研究，如灭活疫苗、GapA、Sip、OCT、PGK、FbsA等，但还没有减毒疫苗。无乳链球菌的减毒疫苗可以迅速激活免疫反应，造价低但能提供持久的免疫。对这种减毒毒株的更多了解可能为开发有效的疫苗铺平道路。

本文所研究的无乳链球菌Streptococcus agalactiae strain HZAUSC001是从广东湛江的一种表现出典型链球菌病临床症状的垂死罗非鱼中分离得到的。它被确定为导致鱼类疾病的病因，但由于其弱毒性而引人注目。本研究中，重新分析了Streptococcus agalactiae strain HZAUSC001的基因组，评估了抵抗力和毒力，并破译了HZAUSC001的衰减特性。

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研究内容

1. 高通量测序得到了无乳链球菌基因组序列，毒力因子，基因数目，GC含量等；
2. 基于已发表的低毒力链球菌基因组序列，进行比较基因组分析，鉴定关于无乳链球菌中存在的抗药性、毒力的基因。

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研究结果

1.Streptococcus agalactiae strain HZAUSC001基因组信息

Streptococcus agalactiaes train HZAUSC001基因组被成功组装，GC含量为35.37%，1972个开放阅读框(ORF)，55840 to 91389位置有一个质粒。碳水化合物代谢相关的基因有290个；59个基因被注释与毒力、疾病或防御相关的基因，仅鉴定出一个耐药相关基因命名为bacA。1218个预测基因与76个KEGG通路相匹配。

 

图1.无乳链球菌HZAUSC001基因组图谱

2.致病菌毒力因子分析

通过VFDB分析，在无乳链球菌HZAUSC001基因组中发现22个预测基因与GBS中的20个毒力因子基因一致。它们可分为不同的功能，包括poreforming毒素(cycle,cfb)、扩散因子(hylB)、宿主细胞粘附和入侵(fbsA,pavA)、免疫逃逸(scpB)和抗吞噬(cpsABCDEFGKL,neuABCD,cba)。抗吞噬基因可以阻止活化的C3b结合到GBS表面，抑制补体通路的激活，并掩盖与细胞壁成分相关的促炎反应，促进免疫逃逸。

表1.无乳链球菌HZAUSC001毒力因子基因

3.基因功能分析

基因组的COG(Clusters of orthologous groups for complete eukaryotic genomes)数据库中对组装的基因进行系统发育分类。基因的COG分类对于功能注释和进化研究具有重要意义。总的来说，2006个基因被分为21个功能类别。

图2.COG功能分类

4.比较基因组分析

为进一步阐明物种进化的分子基础,探索基因起源机制,从基因进化的角度研究基因序列与功能的关系，进行了比较基因组分析。

(1)共线性分析

共线性主要是用来描述同一染色体上基因的位置关系，也就是指由同一祖先型分化而来的不同物种间基因的类型以及相对顺序的保守性(即基因的同源性+基因的排列顺序)。

本文利用Mummer软件进行共线性分析。将Streptococcus agalactiae strain HZAUSC001与Streptococcus agalactiae strain GD201008-001两株菌进行共线性分析，发现这两株菌有98.78%相似。

图3.共线性分析

(2)进化树分析

利用树状分支图形来表示各物种或基因间的亲缘关系。系统发育分析表明，strain HZAUSC001与GBS菌株GD201008-001和ZQ0910在进化上相似。在减毒菌株Streptococcus agalactiae strain HZAUSC001中不存在三种毒力基因bca(C蛋白α-抗原)，cpbA(胆碱结合蛋白A)和esp(肠球菌表面蛋白)。而这些基因是毒株Streptococcus agalactiae strain GD201008-001所包含的，推测这三个毒力基因的缺失可能与HZAUSC001菌株的减毒特性有关。

图4.进化树分析

毒力基因分型是检测菌株携带或缺失某些毒力基因，根据细菌毒力基因谱特征而进行菌株分型。BCA(C蛋白α-抗原)，CPBA(胆碱结合蛋白A)和ESP(肠球菌表面蛋白)在减毒株HZAUSC001中不存在，可作为减毒疫苗开发的极佳候选者。减毒疫苗能有效诱导免疫应答，通常在低剂量下就达到终生免疫，目前，仅少量的无乳链球菌减毒疫苗被开发，这项研究结果有助于进一步开发无乳链球菌减毒疫苗，控制GBS流行病学。

同疾病较量最有力的武器就是科学技术，通过高通量测序获得更多关于无乳链球菌HZAUSC001的知识可促进疫苗的开发。本次新冠疫情中，中国的研究团队在收到不明原因发热患者标本后，只用了短短10天，就通过高通量测序获得了该病毒的全基因组序列(GenBank：MN908947)，基因组信息的突破和共享是全球疫苗开发的关键，大大加速了疫苗研发。目前已经有许多款安全有效的新冠疫苗问世、疫苗产量也越来越高。现在，疫情还在蔓延，防控仍需努力，让我们大家共同落实戴口罩、勤洗手、保持社交距离，积极配合疫苗接种，早日取得抗击新冠肺炎疫情胜利成果。

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