文献精读

中文题目：下调的NDR1通过miR146a-STAT1反馈环路抑制抗病毒天然免疫应答
英文题目：Downregulated NDR1 protein kinase inhibits innate immune response by initiating an miR146a-STAT1 feedback loop
关键词：NDR1、抗病毒免疫反应、ChIP-seq、miR146a-STAT1反馈环路
发表杂志：Nature Communications
阅读时间：20min

研究背景

固有免疫系统是宿主抵抗病原体入侵的第一道防线，固有免疫细胞能够通过模式识别受体（PRRs）识别病原体相关的分子模式（PAMPs），PRRs识别并结合PAMPs后，激活下游信号，经过信号转导诱导I 型干扰素等免疫介质大量产生。I 型干扰素（type I IFN）与细胞膜上的I 型干扰素受体结合，活化与之偶联的激酶，通过JAK-STAT信号转导途径激活下游干扰素诱导基因（ISGs）转录，而ISGs在抗病毒反应中发挥着重要作用。

http://www.ibp.cas.cn/denghylab/denghylabyjfx/201404/t20140428_4101934.html（图片来源）

Toll样受体是一种重要的PRR，表达于固有免疫细胞，如巨噬细胞、树突细胞表面，识别并结合PAMP后启动细胞内信号转导，激活下游免疫反应。miR146a是Toll样受体信号的负反馈调节子，进一步研究表明miR146a靶向影响STAT1和IRAK2等涉及到固有免疫抗病毒反应的蛋白分子的转录。NDR1是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，是各种细胞生命活动中重要的转录调节子，包括中心体复制、细胞凋亡和肿瘤发生，最近有研究报道巨噬细胞中NDR1可以抑制TLR9介导的炎症反应，而NDR1在抗病毒免疫应答调控研究报道非常少。

病毒的高基因突变特性不断产生逃避机体免疫系统监控的机制，从而周期性地引起全球性恐慌和威胁人类生存，研究并深入理解宿主抗病毒免疫应答调控及病毒逃逸机制对于新型、高效抗病毒药物的开发具有重要意义。

文章亮点


NDR1作为转录调控因子结合于miR146a的intergenic区，使STAT1从miR146a介导的翻译抑制中释放出来，上调STAT1的表达，促进IFN途径激活，有益ISG表达，正向调控天然抗病毒免疫。
该研究不仅丰富了NDR1的生物学功能，并揭示机体抗病毒天然免疫应答及病毒免疫逃逸新机制，将为抗病毒药物的研发提供新思路及新靶点。


研究结果（部分）

1. 病毒感染抑制NDR1表达

研究者对比感染了RSV病人和健康人的外周血样本，感染RSV病人的NDR1 mRNA水平显著降低（如图1）。感染RNA和DNA病毒的小鼠腹腔巨噬细胞（PMs）中NDR1的mRNA（如图2）和蛋白量皆下调。用重组小鼠干扰素β和重组人干扰素α分别处理PMs和细胞株Thp1，结果显示IFNα/IFNβ显著降低了NDR1的mRNA和蛋白的表达量，而在IFNαR或者STAT1缺失的巨噬细胞中NDR1表达量在VSV病毒感染前后表达无明显差异（见图3），显示病毒感染抑制NDR1表达依赖STAT1途径。

图 1（左） 感染RSV的病人NDR1mRNA量降低 ；图2（右） 感染病毒的小鼠PMs中NDR1mRNA量较对照组降低

图3 免疫印迹分析NDR1的表达量

2. NDR1促进抗病毒免疫反应

病毒感染后，从NDR1-/-小鼠模型中采集PMs检测抗病毒相关的IFNβ、IL6、TNFα等蛋白的表达量和对照组比较明显减少（如图4）；相对的，在RAW264.7细胞株中过表达NDR1或其激酶活性失活突变体, 病毒感染后，细胞均上调I型IFN和ISGs的表达。用VSV-eGFP感染过表达NDR1或其激酶活性失活突变体的RAW264.7细胞株，FACS分析和TCID50评估结果显示过表达NDR1或其激酶活性失活突变体均显著抑制VSV病毒复制（如图5）。

图4 病毒感染后NDR1-/-PMs和WT中抗病毒相关蛋白的ELISA分析

图5 FACS分析和TCID50评估图

模式小鼠活体实验评估NDR1在机体抵抗病毒感染中的重要性，相较于野生型对照组，NDR1-/-小鼠在VSV病毒感染后，肺部组织病理分析发现更严重的水肿、肺泡大出血和中性粒细胞沁润等（如图6 图左）；对肝实质分析显示，NDR1-/-模式小鼠门静脉炎性沁润较WT小鼠更丰富（如图6 图右）。感染致死剂量的VSV后NDR1-/-小鼠两天内全部死亡，WT小鼠仅有30%因感染死亡（如图7 图左），静脉注射HSV得到同样的实验结论：NDR1-/-小鼠死亡率高于对照组（如图7 图右）。综上所述，NDR1以激酶活性非依赖的形式促进宿主抗病毒免疫反应。

图6 小鼠肝、肺切片染色

图7 NDR1+/+和 NDR1-/-的8周小鼠感染（图左）/注射（图右）的生存率

3. NDR1促进固有免疫反应的机制研究

首先，本文实验证明NDR1通过靶向STAT1提高抗免疫反应，促进IFN途径激活增加ISGs产物，下面来探索NDR1促进抗病毒免疫反应机制。

a.细胞核内NDR1才能增强STAT1表达

普遍认为NDR1是包含核定位序列(NLS)的细胞核内蛋白，最近的研究发现NDR1也是细胞质激酶，这正与本文章实验结果一致：通过免疫印迹分析和共聚焦实验发现，病毒感染前后巨噬细胞的细胞核和细胞质中均发现NDR1蛋白（如图8）。

图8 NDR1细胞定位实验图

删除NDR1的NLS序列，抑制其定位到细胞核中，NDR1对STAT1表达的影响会减弱，（如图9 图左）。补充实验结果显示NDR1-/-的巨噬细胞中STAT1的表达水平显著降低，过表达NDR1恢复其表达量，但是过表达NDR1 ⊿NLS突变体不能恢复NDR1-/-巨噬细胞中STAT1的表达量（如图9图右）。本文的实验结果表明核内的NDR1作为抗病毒蛋白分子促进STAT1表达。

图9 STAT1表达的免疫印迹分析

b.NDR1结合到miR146a的基因间区抑制其转录

本文研究人员假设NDR1为转录调控因子，为了验证这个假设在RAW264.7细胞系中进行ChIP-seq实验：过表达flag-NDR1，使用抗flag抗体免疫沉淀flag-NDR1，分析得到477个NDR1蛋白结合富集峰，其中41.09, 11.32, 42.98和2.10%分别定位在内含子区、外显子区、基因间区和启动子区（如图10 ）。根据Motif分析结果，鉴定出NDR1热点结合模式序列：5′-WCHTBRMAATCG-3′ (W =A or T; H= A, T, or C; B = G, T, or C; R = A or G; and M= A or C)。进而鉴定出两个潜在的位于miR146a基因间区的NDR1结合位点，通过生物素-亲和素介导的DNA-pull down实验证明NDR1以激酶活性非依赖的方式直接结合在mi146a基因间区(chr11: 43303808-43303818)

图10 （左）NDR1 ChIP-seq的peaks分布；图11（右） motif分析

已知人的造血细胞中miR146a的转录受NF-κB正向调控，本文进一步研究NDR1减少NF-κB调节的miR146a的表达量是否依赖于NDR1结合到miR146a基因间区序列。在L929细胞中，利用CRISPR-Cas9系统删除miR146a基因间区中NDR1结合的DNA结合位点（DNS），结果显示NDR1对miR146a、STAT1和病毒诱导的ISGs表达的影响消失（如图12）。一系列的实验结果表明NDR1是通过结合到mi146a的基因间区抑制其转录。

图12 NF-κB富集的qPCR分析和STAT1表达的免疫印迹分析

c. NDR1通过靶向miR146a促进STAT1翻译

正如图13（图左）展示，巨噬细胞中抑制miR146a表达后，NDR1不再影响STAT1的表达量。为了调查研究NDR1对STAT1翻译和促进抗病毒反应的影响是否依赖于miR146a，本文章构建了过表达pre-miR146a的L929细胞系，进一步的实验结果显示：对照组中过表达NDR1能够上调STAT1和VSV诱导的ISGs的表达量， 但是这一影响在过表达pre-miR146a的实验组中消失（如图13 图右）。一系列实验结果表明NDR1上调STAT1表达量、刺激免疫反应需要依赖miR146a。

图13不同条件下STAT1表达的免疫印迹分析

4. miR146a-STAT1反馈环路

细胞中miRNA和转录因子间的协同调控广泛存在，已有报道STAT1和miR-155-5p之间的反馈环路参与肿瘤发生。实验显示敲低和敲除STAT1能够显著提高miR146的表达量（如图14 图左）。研究人员在小鼠的mi146a的启动子区域找到了STAT1潜在的结合序列，ChIP-qPCR结果显示STAT1结合区域和NF-κB的相重叠，猜测两者竞争性结合miR146a的调控序列。在STAT1-/-和WT巨噬细胞中用抗NF-κB抗体做ChIP实验，前者结合miR146a调控序列的NF-κB量显著增加（如图14 图中）证实了这一假设。miR146a和STAT1相互抑制：miR146a通过靶向STAT1mRNA的3′-UTR下调其翻译，而STAT1结合到miR146a启动子区域抑制其转录组，形成反馈环路（如图14 图右）。

图14 miR146a的qPCR分析（图左和图中）、NF-κB富集的ChIP-qPCR分析（图右）

文章结论

该研究发现Dbf 2相关激酶1(NDR1)以激酶活性非依赖形式促进体内外抗病毒天然免疫应答。NDR1基因敲除小鼠对病毒及李斯特杆菌的感染表现出更高的易感性。通过ChIP-seq研究发现，NDR1作为转录调控因子结合于miR146a的intergenic区。而结合于miR146a的intergenic区的NDR1抑制了miR146a转录，使STAT1从miR146a介导的翻译抑制中释放出来，上调STAT1的表达，正向调控天然抗病毒免疫反应。

同时该研究还发现，STAT1 作为负向转录调控因子结合到miR146a的启动子区抑制miR146a的表达，揭示miR146a-STAT1相互抑制环路。更为重要的是，病毒和细菌入侵通过I型IFN信号通路下调 NDR1 的表达，导致miR146a表达上升，STAT1 表达下降，抑制机体抗病毒免疫应答。

Downregulation of NDR1 due to viral infection inhibits the innate immune response by initiating an miR146a-STAT1 feedback loop. 

致谢：
非常感谢文章作者（共一）刘志勇博士对本篇解读提出的宝贵意见！