金唯智假病毒研究进展

1. Spike蛋白假病毒简述

利用金唯智慢病毒包装系统平台,将VSV-G序列替换为目的S蛋白,质粒共转染293T细胞后,包装假病毒并感染ACE2稳转细胞。目前,本公司已成功建立了SARS-CoV-2 S蛋白、SARS S蛋白、MERS S蛋白假病毒包装平台,包括GFP标签及luciferase标签(图1及图2)。同时,对SARS-CoV-2 S蛋白突变体进行了假病毒包装,成功包装各突变体S蛋白假病毒显示D614G突变体(目前该突变体为世界主要流行毒株)假病毒感染ACE2稳转细胞的能力强于野生型SARS-CoV-2 S蛋白假病毒(图3)。

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图1 SARS-CoV-2 S蛋白、SARS S蛋白、MERS S蛋白、VSV G蛋白假病毒(GFP标签)分别感染293T-ACE2稳转细胞及293T-DPP4瞬转细胞结果。左图:荧光显微镜检测假病毒感染效率;右图:FACS检测假病毒感染效率。

 

luciferase标签假病毒

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图2 SARS-CoV-2 S蛋白、SARS S蛋白、VSV G蛋白假病毒(luciferase标签)分别感染293T-ACE2稳转细胞结果

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图3 SARS-CoV-2 S蛋白野生型及突变体假病毒包装效率。左图:荧光显微镜检测假病毒感染效率;右图:FACS检测假病毒感染效率。

2. 假病毒包装效率的提高

为进一步提升假病毒包装效率,对慢病毒系统质粒进行了改造,改造后,假病毒包装效率提升3-4倍(图4),为假病毒生产节约了大量成本。利用本公司293悬浮细胞系统,建立了假病毒悬浮包装平台(图5),为客户大量定制假病毒提供了可能。

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图4 包装质粒改造前后SARS-CoV-2 S蛋白假病毒包装效率。左图:荧光显微镜检测假病毒感染效率;右图:FACS检测假病毒感染效率。

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图5 SARS-CoV-2 S蛋白、SARS S蛋白、VSV G蛋白假病毒贴壁及悬浮系统包装结果

3. 假病毒的多种定量检测方法

建立了假病毒定量检测方法,包括FACS、qPCR、Elisa,有限稀释法等,由于检测方法的差异,各定量方法均有一定差异(图6),这些方法从不同方面表征病毒的滴度,有其各自的不可取代的作用。

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图6 FACS、qPCR、Elisa对假病毒定量结果比较。上图:qPCR定量结果与FACS定量结果比较;下图:Elisa定量结果与FACS定量结果比较。

4. 假病毒活性鉴定

对包装的SARS-CoV-2 S蛋白、SARS S蛋白假病毒开展了功能性实验。为验证包装的假病毒活性,开展了入侵抑制实验(包括抗体、lactofferin对假病毒的入侵抑制)及假病毒感染不同物种ACE2细胞的能力,实验结果显示20 μg/mL抗体对SARS病毒有一定的中和作用(图7),50 μM lactofferin对SARS、SARS-COV-2均有一定抑制作用(图8),SARS-COV-2感染人ACE2、菊头蝠ACE2、浣熊ACE2、猩猩ACE2的效率无明显差异,SARS感染浣熊ACE2效率较差(图9)。

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图7 不同浓度抗体对SARS S蛋白假病毒抑制作用。上图:荧光显微镜检测假病毒感染效率;下图:FACS检测抗体对假病毒入侵抑制效率。

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图8 不同浓度lactofferin对SARS-CoV-2 S蛋白、SARS S蛋白假病毒抑制作用。上图:荧光显微镜检测假病毒感染效率;下图:FACS检测抗体对假病毒入侵效率。

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图9 SARS-CoV-2 S蛋白、SARS S蛋白假病毒感染不同物种ACE2 

5. Spike假病毒科研价值

由于SARS-CoV-2病毒传染性强,危害性大,对该病毒的操作必须在BSL3实验室进行,而大多数科研单位或企业并不具备BSL3级别实验室。SARS-CoV-2 S蛋白假病毒不具备复制能力,不具致病性,安全性高,可操作性强,只需要在BSL2实验室进行操作,因此,假病毒的开发,有助于疫苗、药物、中和抗体的快速开发。目前为止,本公司生产的SARS-CoV-2 S蛋白假病毒已服务于超100个科研单位及企业,助力了SARS-CoV-2疫苗、药物、中和抗体的快速开发。

目前的研究报道已经确认,新冠病毒SARS-CoV-2的细胞膜表面受体和非典病毒SARS-CoV一样都是ACE2蛋白,治疗新冠肺炎的一个有效途径就是阻断病毒与ACE2结合的过程。为了给客户提供相关科研服务,我们公司迅速建立了高效的新冠假病毒的分子构建和包装生产线,使得客户可以安全得进行新冠病毒的相关研究。同时,为了验证假病毒的侵染能力,需要相应的易感细胞系,最常见得易感细胞系是来源于非洲绿猴的Vero e6细胞系。而为了更好的研究新冠病毒侵染人体的情况,研究者需要相应的人源化易感细胞,所以我们以实验室最常用的HEK293T为起点,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和慢病毒包装感染技术,构建了可以用于新冠假病毒检测的HEK293T-ACE2细胞系。

根据文献报道,HEK293T对于新冠假病毒的敏感度较低(图10),我们自己的假病毒测试中,HEK293T的感染率也非常低。所以为了更好的测试假病毒,我们在每次测试假病毒前,都会在HEK293T细胞中转染过表达ACE2,以提高新冠假病毒的阳性率。为了给客户提供更好的新冠假病毒测试平台,我们设计构建了稳定表达ACE2的HEK293T细胞系,即可以简化实验流程,也可以让实验数据产出更加稳定。

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图10 新冠假病毒在不同物种的细胞中的侵染效率(https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.052)

6. ACE2过表达细胞系

HEK293T细胞本身ACE2表达水平较弱,所以对新冠假病毒的敏感性不高,但为了减少背景干扰,我们仍然先将内源的ACE2敲除后,再异位稳定表达外源ACE2。

1) 敲除内源ACE2

2) 稳定表达外源ACE2

在内源ACE2敲除的基础上,我们再利用慢病毒感染稳定表达外源的ACE2。同时,根据一些文献报道,人群中存在各种ACE2基因的SNP(图11),其中一些点突变可能会影响新冠病毒和ACE2的相互作用,最终可能反映在不同人群对于新冠病毒的抵抗能力差异上。为满足这方面的研究需求,我们在构建野生型ACE2基因稳定表达细胞系的同时,也构建了大量突变型ACE2基因的稳定表达细胞系,并对野生型以及一些高频出现的突变型进行了假病毒感染测试。

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图11 人群中常见的ACE2 SNP(https://doi.org/10.1038/s41421-020-0147-1)


首先对慢病毒感染获得单克隆细胞系进行了Western Blot鉴定,通过外源ACE2携带的His进行检测(图12)。然后我们选取其中高表达的单克隆细胞系进行下一步的假病毒实验。

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图12 western鉴定外源ACE2的表达水平(标红的为进行后续实验的单克隆)

金唯智生产的假病毒携带了EGFP表达序列,方便客户通过绿色荧光统计假病毒的侵染率。使用非典(SARS-CoV)和新冠(SARS-CoV-2)的假病毒分别感染这些细胞系,通过绿色荧光细胞出现的机率衡量各种ACE2稳定表达细胞系(图13)。流式细胞仪分析的荧光结果表明,稳定表达ACE2的HEK293T细胞系大多能够达到瞬时转染ACE2(ACE2-OE)的侵染率;而不同ACE2 SNP的稳定细胞系具有不同的细胞侵染率,可能是ACE2蛋白表达量不同的影响,也可能是SNP造成的氨基酸突变的影响。

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图13 利用假病毒测试不同细胞系的侵染率

总结来说,金唯智在建立高效的新冠假病毒的分子构建和包装生产线的基础上,为客户提供了稳定的人源化假病毒测试细胞,省去了每次实验都需要瞬时表达ACE2的繁琐工作,进一步为新冠病毒的科学研究和预防治疗提供助力。