ITR测序

腺相关病毒基因组(adeno-associated virus, AAV)的反向末端重复序列(inverted terminal repeat, ITR)能形成高度稳定的二级结构,利用现有技术很难进行序列验证。为了突破这重障碍,GENEWIZ研制了一种新型专利技术,运用前所未有的测序方法,清晰地分析这些复杂序列,助力研发人员有效地评估ITR区域的完整性。
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图1. AAV2的ITR序列的示意图。ITR由两个回文臂(B-B'和C-C')和一个长茎回文(A-A')组成。D序列在AAV基因组的每一端只出现一次。

 

腺相关病毒(AAV)是一种单链DNA病毒,在基因治疗中通常作为载体将外源基因转入患者中。AAV基因组的每条单链DNA包括两端的反向末端重复序列(ITR)和中间的2个开放性阅读框。ITR在病毒的复制和包装过程中起着关键作用,并且参与了病毒基因组在宿主基因组上的整合和逃逸过程。该序列中CG含量达80%以上,其前125bp(1~125)序列依次可分为A、B、B’、C’、C、A’等不同的区段(图1),其中B与B’、C与C’反向互补,可形成T型发夹结构,作为AAV的DNA自我复制的起点,随后的20bp形成特有的D序列。


GENEWIZ开发了一种新型的ITR测序方法,可以改善ITR区域的测序信号并延长读取长度。

测序服务类型

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    图2. 使用T公司的测序试剂盒对AAV2的ITR区域进行测序

    红色下划线标记序列后的碱基“CCTGC”是一个无法成功测序的发夹结构的开端。

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    图3. 使用GENEWIZ AAV-ITR测序法测定AAV2的ITR区域的色谱图

    红色下划线的序列表示图2中提到的相同序列。红框内显示完整的发夹结构。

ITR测序服务优势

有效

AAV-ITR测序方法能有效评估AAV质粒中ITR区域的完整性,迅速准确地检测到ITR区域的突变,为下游故障的排除节省时间和精力。

支持

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送样要求

样品类型:质粒

送样体积:体积≥10ul,每增加一个反应,送样体积增加5ul

引物要求:遵循引物设计规范,且设计的引物位置距离ITR区域150-350bp

样品浓度:浓度在200ng/ul-400ng/ul之间(最低不能低于150ng/ul,浓度过高需稀释)

 样品介质:使用双蒸水溶解

其他要求:送样时需注明浓度和质粒大小,外包装需明显标注“ITR测序”字样

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