AAV载体构建

基因治疗(Gene Therapy)是指将外源基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病。腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)作为基因治疗的一种明星载体,对于人类攻克癌症或更多的重大疾病有着巨大的潜力。AAV质粒中的反向末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR)完整性对rAAV (recombinant adeno-associated virus) 的构建至关重要。缺失突变的ITRs会降低完整AAV病毒的产量,增加非目的DNA包装的产生。

为此,GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、错误ITR的修复和rAAV质粒大量制备的方法——Hi-Fi技术,该方法的核心点不仅仅是制定了更简单、灵活和快速的克隆方案,而更重要的是发明了一种特殊的大肠杆菌细胞及其培养条件,使rAAV质粒的ITR在细菌中的扩增过程保持稳定,不易发生缺失。


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AAV载体构建

技术细节

GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、错误ITR的修复和rAAV质粒大量制备的方法——Hi-Fi技术,该方法的核心点不仅仅是制定了更简单、灵活和快速的克隆方案,而更重要的是发明了一种特殊的大肠杆菌细胞及其配套使用的AAV稳定剂,较现有的方法更能使rAAV质粒的ITR在细菌中扩增过程中保持稳定,不易再发生缺失(表1)。

 

表1:5个随机AAV构建后ITR的正确性

 感受态细胞 结果
   Sample1  Sample2  Sample3  Sample4  Sample5
 Sl3  0%(0/8)  0%(0/8)  n/a   100%(10/10)  91.7%(11/12)
 Sl4  0%(0/8)  0%(0/8)  n/a   100%(10/10)  83%(10/12)
 Sla  0%(0/8)  0%(0/8)  n/a   100%(10/10)  83%(10/12)
 Sle  0%(0/8)  12.50% (1/8)  100% (8/8) 100% (8/8)   100% (8/8) 
 B83  0%(0/8)  0% (0/8)  100% (8/8)  87.50% (7/8)  87.50% (7/8)
 Hi-Fi  87.5% (7/8)  100% (8/8)  100% (8/8)  100% (8/8)  100% (8/8)

 

基于感受态细胞的对比数据,金唯智进一步探索了Hi-Fi技术流程在转化筛选正确克隆过程中的能力。由于ITR本身的不稳定性,在质粒构建的过程中,会有发生突变的可能性。

原始质粒:

原始质粒20200305-2

第一次转化结果:

20200309-1

 

目前金唯智基于Hi-Fi技术可以提供rAAV的质粒构建,ITR区域的修复和rAAV质粒大量制备以及AAV病毒包装等相关服务。

 

 

技术流程

20200309-2

 

发货标准


AAV-ITR构建、修复:ITR区域测序并确保正确;2-5 ug,≥90%超螺旋。

升级服务:内毒素≤10EU/mg;ug-g级别的发货量;0.22um过滤除菌。

AAV-ITR大抽: ITR区域测序并确保正确。

服务优势


先进的合成技术:可以合成高难度重复序列,高GC含量的困难序列以及含有发夹结构的ITR区域。

免费的表达系统优化:可以根据表达系统对目的基因进行密码子优化。

完善的服务流程:可以提供从基因合成,载体构建到病毒包装的一站式服务。

质量可靠:酶切和测序双重检测,金唯智自主研发的ITR测序技术能够测通ITR区域,确保序列100%正确。

周期短:rAAV-ITR载体构建最快8天起。

案例分享

1、项目类型:Hi-Fi 技术构建 rAAV 载体

目的基因以及ITR区域合成之后,构建AAV载体之后,再利用SmaI酶进行酶切后,验证条带大小。

20200306-31

图5: 酶切图,L1: undigested;L2: digested with SmaI and BsrGI;L3: ladder 5000


条带大小正确后,再利用sanger测序技术,测定目的基因和ITR区域序列:

20200309-4

图6:ITR区域测序图

上图可以看出,Sanger测序验证了rAAV左右两侧的ITR区域序列正确。从而确保rAAV载体构建正确。

 

2.、项目类型:Hi-Fi技术修复ITR序列

AAV原始质粒ITR缺失突变,常规PCR扩增很难直接完成序列修复,金唯智通过特定修复方案及Hi-Fi技术流程,成功交付多例修复质粒。

 

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