定点突变

CRISPR/cas9基因定点修复原理:
CRISPR/Cas是一种原核生物的自适应免疫系统,抵御来自噬菌体或外源质粒的入侵。这个原核生物系统的已广泛被分子生物学所采用,目前已成为基因组工程最强大和最通用的平台之一。 CRISPR/Cas9是一种简单而快速的工具,不仅可对各种物种(动物、植物、微生物等)中的内源基因进行有效修饰(敲除、敲入、定点突变),对其进行优化还可实现强大的转录抑制或靶基因的激活。CRISPR/Cas9的简便性使其在许多领域广泛应用,包括基础研究,生物技术和生物医学[1,2,3]
CRISPR/Cas9编辑系统是在sgRNA(约20nt,与靶基因序列互补)的引导下,Cas9特异性切割目标基因,造成DNA双链的断裂(double-strand DNA breaks,DSBs),从而引起生物体内的DNA损伤修复。这种修复作用主要包括两种途径,一种是利用非同源重组(NHEJ)的修复,即易错修复,可能造成基因组的随机插入或缺失突变,这种方式常导致靶基因失去功能,基因敲除就是利用该修复机制[1,2]。另一种是利用同源重组修复(HDR),即精准修复,借助外源引入一段与预期编辑位点上下游紧邻且高度同源的DNA修复模板(donor,可以是短单链DNA序列(ssDNA)或质粒)介导序列的替换或插入,基因敲入和定点突变就是利用该修复机制[3]


服务标准

   客户需提供 金唯智交付  交付周期 
 标准服务 基因序列和NCBI ID
宿主细胞
细胞株培养条件
突变位点信息
基因定点修复单克细胞一株(纯合/杂合)
细胞cofA文件
测序结果
 12-16周

 

 
*注:一般由客户提供宿主细胞系,如果需要由金唯智提供宿主细胞系,需要额外收费。
*如果宿主细胞使用的是常规培养基,如:RPM1640、DMEM、MEM等无需客户提供,如果是特殊培养基及添加物,需要客户提供。

 

定点修复细胞系构建流程:

定点修复细胞系构建流程

 
案例分析1:Analyses of point mutation repair and allelic heterogeneity generated by CRISPR/Cas9 and single stranded DNA oligonucleotides.

HBBHBBsgRNAssDNA

图1. 野生型HBB和镰状细胞HBB基因型及设计的sgRNA序列、ssDNA序列[4]
  
K562细胞中的β珠蛋白基因(beta globin gene)是基因编辑的公认且众所周知的靶标,特别是关于镰状细胞病。 β珠蛋白基因的第六个外显子中的突变与镰状细胞病的发作有关(镰状细胞中为A,野生型细胞为T),因此,作者通过基因编辑手段模拟该发病过程。作者选择了脱靶率低的sgRNA序列。并标注了其产生的DNA双链断裂(DSB)位置,设计了72nt的ssDNA模板,最终筛选得到的#22阳性克隆的基因型[4]

22克隆的基因型鉴定结果

图2. #22克隆的基因型鉴定结果[4]
测序分析显示:#22克隆为杂合子,一种基因型成功突变,一种基因型发生InDels(插入GA),剩余一种基因型既成功突变又发生InDels(插入GCA)[4]

 

其他克隆的基因型鉴定结果

图3. 其他克隆的基因型鉴定结果[4]


本实验一共筛选26个单克隆,其他克隆的基因型鉴定结果统计如上图[4]

参考文献:
[1] Nelly M. Cruz and Benjamin S. Freedman. CRISPR Gene Editing in the Kidney. Author manuscript, Am J Kidney Dis . 2018;71(6): 874–883.
[2] Hryhorowicz M, Lipinski D, Zeyland J, et al. CRISPR/Cas9 immune system as a tool for genome engineering. Arch Immunol.2017;65(3):233–240.
[3] Savi´c, N.; Schwank, G. Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Transl. Res.2016; 168,15–21.

[4]Bialk, P., B. Sansbury, N. Rivera-Torres, K. Bloh, D. Man and E. B. Kmiec. Analyses of point mutation repair and allelic heterogeneity generated by CRISPR/Cas9 and single-stranded DNA oligonucleotides. Sci Rep. 2016;6: 32681.
 

 

金唯智提供的CRISPR/Cas9技术服务的授权来自Broad研究所。