CRISPR-Cas9文库

CRISPR-Cas9文库又称全基因组CRISPR-Screen,或者高通量基因编辑技术,是一种由Broad研究所的张锋团队开发的,基于CRISPR-Cas9系统,通过构建全基因组sgRNA文库同时对多个细胞的不同基因进行编辑,辅助以特定的筛选方案,通过NGS测序和生信分析的手段,筛选出符合条件的候选基因【1】。
金唯智现在提供Broad研究所授权的现货供应,针对Human和Mouse全基因组多规格、高质量的CRISPR-Cas9敲除文库,实现了全基因组功能基因的快速筛选;同时根据客户的需求,金唯智还提供任意物种的sgRNA文库设计,构建至Broad研究所授权的或客户自行提供的载体中,文库质粒构建和质检的服务;针对可以进行慢病毒包装的质粒还提供各种规格的慢病毒包装服务;另外对于动物细胞,金唯智还提供sgRNA文库设计、质粒构建及NGS质检、慢病毒包装、Cas9稳定表达细胞系、大规模细胞筛选实验后NGS测序分析,直至交付客户最终的分析报告的一站式服务!


CRISPR-SCREEN筛选详细流程

进行CRISPR-SCREEN需要经过多个流程和多个技术平台,详细的实验流程见图二;

 

CRISPR-SCREEN全流程总览

图二:CRISPR-SCREEN全流程总览

CRISPR-SCREEN对于技术平台的-1要求

图三:CRISPR-SCREEN对于技术平台的要求[3]

  

CRISPR-Cas9文库应用方向

1. 药物靶点确定与验证

CRISPR-Cas9文库筛选技术可以应用于药物靶点筛选中,通过大规模筛选技术,系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因,从而为疾病治疗提供相关的理论基础。

2. 基因环路上下游调控机制分析

CRISPR-Cas9文库筛选技术不仅可以用于编辑人类细胞蛋白编码基因,对于基因组中的调控元件也同样有效,利用这种方法可以对基因环路上下游调控机制进行分析。
 

3. 代谢通路调节机制分析

CRISPR-Cas9文库技术可以应用于动植物的代谢通路条件机制分析。
 

4. 病毒侵染宿主细胞的受体蛋白筛选:

通过CRISPR-Cas9文库技术可以快速的对病毒侵染宿主细胞的受体蛋白进行筛选和鉴定,科学家就曾通过CRISPR-Cas9全基因组文库筛选技术,成功发现并证实LDLRAD3蛋白是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)进入动物和人类细胞的受体,以及筛选出冠状病毒侵入宿主细胞的受体蛋白以及与新冠病毒相关正相关和负相关的重要基因。
 

金唯智产品介绍


文库名称  sgRNA设计信息 
 Human_GeCKOv2_Library_A  数目:63383条sgRNA
 靶向19050个基因,每1个基因包含3条gRNA;
1864个miRNA,每1个miRNA包含4条gRNA; 
1000条对照(非靶向性)gRNA。 
 Human_GeCKOv2_Library_B 数目:58028条sgRNA 
靶向19,050个基因,每3条gRNA靶向1个基因; 
1000条对照(非靶向性)gRNA。 
 Mouse_GeCKOv2_Library_A 数目:67405条sgRNA 
靶向20611个基因,每1个基因包含3条gRNA; 
1175个miRNA,每1个miRNA包含4条gRNA; 
1000条对照(非靶向性)gRNA。 
 Mouse_GeCKOv2_Library_B 数目:62804条sgRNA 
 靶向20611个基因,每1个基因包含3条gRNA;
1000条对照(非靶向性)gRNA。 

现货质量标准

    

现货质量标准_1

覆盖度:NGS测序分析sgRNA数量与预期sgRNA数量的比值,越接近100%,说明文库质量越好。

均一性:均一性根据各样本 sgRNA 数目,统计其分布斜率,并进行可视化展示,如上图所示。累积分布达到90%时对应的 sgRNA 数目与累积分布达到10%时对应的 sgRNA 数目的比值即为文库的均一性,一般认为,均一性 < 10,则文库均一性合格,越接近1文库均一性越好。

注:均一性对实验的影响:均一性越低,不同sgRNA之间越平均,出现低频sgRNA数目越少,在后续实验过程中由于sgRNA文库质量而丢失的可能性越低,最终分析结果则越接近真实情况。

金唯智现货文库质检信息

覆盖度:≥99.99%
NGS测序深度:≥300x
均一性:2.5-3.0

金唯智定制化CRISPR-Cas9文库服务介绍及优势介绍

SgRNA文库设计优势

可设计任意NCBI数据库中存在的物种或基因的sgRNA
可定制特定物种全基因组文库和亚文库
可一次设计上万条sgRNAs
特异性强

sgRNA文库构建及质检的优势:

 · 可提供Broad研究所专利授权的CRISPR-Cas9文库载体(LentiCRISPR v2和LentiGuide-Puro),也可以克隆至客户指定的载体中。

 · 具有丰富的文库构建技术经验和成熟的NGS测序平台,确保文库质量。

 · 交付的产品为高达500 μg或更高规格的无内毒素质粒,可直接用于病毒包装或下游应用。

 · Oligo pool的长度最长可达300 nt;满足更多的客户需求。

 · 可以提供1.0E+09TU~1.0E+10TU规格的慢病毒包装服务,满足客户对大量病毒的需求。

金唯智定制化sgRNA文库质量标准

覆盖度:≥99%
质粒总量:≥500 μg(无内毒素)
均一性:<8
NGS测序深度:≥300x

案例分析

 

文库编号  文库1  文库2  文库3 
 平均测序深度  1015  420  444
 均一性  2.36  2.64  2.57
 覆盖度  100%  100%  99.97%

 

案例说明:我们统计了三个不同sgRNA库容量大小的的质量标准分析,分别代表了亚文库,全基因组文库和超大文库三种不同应用场景的文库;通过NGS测序分析,结果表明:金唯智构建的文库质量,覆盖度和均一性都具有较高的标准。

 

CRISPR-Cas9文库应用技巧分享

为了让更多的研究者了解和应用CRISPR-Cas9文库技术,并利用这项技术进行更多的研究,金唯智对CRISPR-Cas9文库技术的应用中可能遇到的问题,根据本公司多年的项目经验,进行了深度解析,帮助有兴趣的客户了解这项技术。

链接:https://mp.weixin.qq.com/s/VRrrVLlVJDKYsdaJyN75pQ

 

参考文献:
[1] Konermann, Silvana, et al. "Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex." Nature 517.7536 (2015): 583-588.
[2] Wei, Jin, et al. "Genome-wide CRISPR screens reveal host factors critical for SARS-CoV-2 infection." Cell (2020).
[3]Feng Zhang et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science  (2014)
[4] Hartenian E, Doench J G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology[J]. Febs Journal, 2015, 282(8):1383-1393.
[5] Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7
[6] Korkmaz, G., et al., Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 192-8.
[7] Li, R., et al., Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum. Plant Biotechnol J, 2017
[8] Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol, 2016.34(12): p. 1279-1286.
[9] Ma, Hongming, et al. "LDLRAD3 is a receptor for Venezuelan equine encephalitis virus." Nature (2020): 1-7.

 

 

金唯智提供的CRISPR/Cas9技术服务的授权来自Broad研究所。