Sanger测序常见问题

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欢迎使用安升达的服务！我们会提供给新客户一份安升达新客户体验券来免费试用我们的Sanger测序服务。需要您做的就是发送邮件至Support.Asia@Azenta.com 或拨打安升达的免费服务电话400-8100-669选项1，以了解更多的服务信息。

当然可以！我们欢迎全世界的顾客。在建立账号的过程中，会被要求填写所在城市，如果您身处国外，请在下拉菜单中选择“其它”，并请提供正确的城市和邮编。所有其它的地区请按实情填写。

安升达始终遵循“以客户为导向”的经营理念。我们已经成为Sanger测序和包括基因合成在内的分子生物学服务的领军者之一，能够为客户提供最佳价值组合：快速提交结果、专业的技术服务、具有竞争力的价格以及细致周到的客户服务。 欢迎您选择安升达！

常规测序服务是指针对各种类型DNA模板的测序。客户分别提交测序模板和引物（或者使用安升达的通用引物），由安升达测定样品的浓度，确定测序反应的使用量，然后进行的测序。

绝大多数的测序反应结果都没有问题，但是注意以下几点可以尽量避免产生不理想的测序结果。 以下是我们的样品准备指南，以帮助您优化测序结果：

1）尽量遵循Sanger测序样品制备指南的要求制备样品。DNA模板和测序引物的质量是影响测序结果的主要因素。

2）确保您的引物与模板完全匹配。引物与模板不完全匹配可能导致测序结果不佳。测序引物长度应在18-24bp之间，退火温度56-60℃，GC含量45-55%。

3）避免污染物的污染。盐、EDTA、酒精、蛋白、RNA、洗涤剂、铯和苯酚是最常见的污染物，会造成测序结果不佳或测序失败。

4）请确保选择正确的测序服务类型。对于某些特殊的模板（如含发卡结构或富含GC的模板），为了得到好的测序结果，请在测序订单中注明其“序列特点”。

我们保证一个成功的测序反应的有效读长是800bp。如果您的目的片段大于800bp，您可以选择测通，我们会根据您的插入片段长度设计引物进行加测。

质粒、PCR产物（PCR已纯化或者单一条带的PCR原液）、细菌（菌落或甘油菌）、环状基因组的噬菌体（噬菌体上清液或噬菌斑）都可以进行。 “预混合服务”只针对质粒和已纯化PCR。

登录您的安升达账户，点击账户信息下的邮件配置，选择您想要接收的邮件。

对于测序要求为测通的订单我们会为您直接拼接的，如无法拼接会为您设计引物加测直至可以拼接；您也可以在订单备注“需拼接”或电话，邮件与我们联系要求拼接结果。

请尽量遵循Sanger测序样品制备指南的要求准备样品。

建议您使用分光光度计，如NanoDrop,检测260/280和260/230的比值来检测样品的浓度。也可以利用一小部分DNA样品通过琼脂糖电泳，并利用已知浓度的marker作为参照，进而确定DNA模板的浓度。

长度小于200bp的样品不适合测序验证，建议将片段克隆后再用质粒进行测序。

可以！安升达有针对复杂结构的测序方案，能够成功地对富含GC的和含复杂二级结构如发卡结构的模板进行测序。在提交订单时，请在“序列特点”选择样品的序列特点。

除特殊情况外，模板和引物的保存时间是1个月。由于菌液和平板菌落很容易老化，我们的保存时间是半个月。如果您的DNA样品和引物还要用于后续订单，请将此注明在订单的“备注”部分。 我们不建议您使用保存时间过长的样品进行测序。如果您需要加测，建议您重新送样品和引物。 建议您每次在送样时对样品备份。如果多次测序使用完了您送的样品，我们一般不负责重新制备。

请将您的PCR模板和引物分开存放，并贴好标签。建议提供一张模板的凝胶照片，并注明上样量。在提交订单时，请在服务类型中选择“需切胶PCR原液”，我们会根据您的凝胶照片对PCR产物进行纯化并优化测序结果。

您可以任何品牌的PCR板和盖子。请保证你的样品在96孔板中是成列或垂直方向排列即可。

我们建议您在送样前保留一份样品的备份，防止样品在邮寄过程中丢失等不可抗拒的因素影响。

为了积极响应政府疫情防控号召，即日起，我司暂停进行与新冠病毒N基因和ORF1a/1b（全序列或部分序列）相关的测序服务。

在测序仪中，每个含荧光标记末端的片段，经毛细管电泳至指定位置时会释放出荧光信号，该信号被CCD图像传感器捕获。记录下荧光信号的峰值被最终整理生成轨迹数据文件（即序列图谱，*.ab1文件）。不同的碱基使用不同颜色的荧光标记，使用序列分析程序即可根据这些峰值判断出对应的碱基。

碱基的质量值(Quality Value)用于量化评估该碱基的可信度，由序列分析程序根据该碱基的峰形计算得出（QV = -10log10Pe；Pe—Probability of Error, 误差率）。QV越高，误差率越低。QV与Pe的对应关系为： 质量值（QV） 误差率（Pe） 1～10 79%- 10% 11-20 7.9%-1.0% 21-30 0.79%-0.10% 31-40 0.079%-0.010% 50及以上 0.001%及以下

测序结果的序列质量得分(Quality Score, QS)是序列中所有碱基质量值(Quality Value)的平均值，用于判断测序结果整体的可信度。 关于有效读长，安升达选用的标准为序列连续读长(Contiguous Read Length，CRL)。即整个序列中，各个碱基质量值均大于20(可信度大于99%)的片段里，最长片段的长度。

测序结果无任何明显干扰，前800bp连续可读。通常菌液或质粒样品，一个测序反应读长可达1000bp，由于Sanger测序的局限性前50bp可能存在误差；PCR产物测序常以终止信号A尾结束。

点击查看峰图实例。

建议您在目标序列上游100bp处设计测序引物。如果没有缓冲区域，就在序列上游的50-60碱基处设计引物。但是与目标序列越靠近，就越容易错过部分目标序列。引物的长度应为18-24bp，退火温度为56-60℃，GC含量为45-55%。您也可以利用引物设计软件来设计引物，主要影响因素包括引物的Tm值、GC含量和二聚体。

可以。如果您知道引物的序列，仅需要在测序订单中注明即可。如果您需要安升达为您设计引物，请在订单中注明目标序列中的相关信息发邮件至Support.Asia@Azenta.com。

请点击查看安升达提供的通用引物。
您可以使用同一页面中的安升达通用引物选择工具，查询测序所需的引物。

如果首次未扩增出片段或浓度无法达到测序要求，我们默认会根据实际情况调整方案重新扩增，若两次均扩增失败则更新为重新扩增失败的状态。

扩增后得到的片段有时会存在非特异性条带，需要进行切胶纯化。样本在回收过程中就会出现一定的损耗，导致得到的已纯化PCR产物浓度无法达到测序要求。

我们可以免费为您解决测序过程中遇到的各种难题。如果测序失败，我们会发送给您一份说明文件，标注出失败原因，您也可以联系我们的技术支持 ，或者发送邮件至Support.Asia@Azenta.com来寻求帮助。

针对无信号、高背景和衰减三种失败类型，我们将按照一定的比例安排重测，若重测结果成功，则将与其失败原因相同的其他样品按照同样的方法安排重测。您可以联系我们的技术支持 ，或者发送邮件至Support.Asia@Azenta.com来寻求帮助。

当聚合酶遇到序列中的polyA或polyT时，往往会发生移滑，进而导致测序结果的非特异性或不理想。每当出现这种情况时，我们就会建议进行反向测序，以得到缺失的序列数据。

引物越长，Tm值就越高，测序反应过程中的DNA模板就越不容易退火，可能就会产生不理想的结果。我们建议您使用安升达通用引物或者您自己设计的引物长度要在18-24bp之间，退火温度为56-60℃，GC含量为45-55%。

最有可能的原因是引物降解，另一个原因可能是您的PCR引物虽然适合于PCR反应，但是不适合用于测序反应。我们建议您的测序引物长度在18-24bp之间，退火温度56-60℃，GC含量为45-55%。PCR引物越长，测序结果可能越不理想。而且，并不是所有的PCR引物都适合被用做测序引物。如果您的PCR引物对测序结果不利，我们建议您设计巢式引物来作为测序引物。

Sanger测序常见的失败类型如下，请点击链接查看具体的原因及解决办法。

Poly结构或重复序列	高背景
光谱拉高	弥散
气泡	衰减
套峰	无信号
引物问题	中断

由于样品的保存期为1个月，因此有效投诉期为1个月之内，1个月后视为无效投诉，不予处理。