Sanger测序样品制备指南


 

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如果您有疑问或需要咨询项目相关事宜,可以随时联系安升达的技术支持。

Email | 400-8100-669 选项 1


样品准备

请按照以下步骤准备样品:

  1. 如果您的测序样品数量≥48个,建议您将样品分装于96孔板中并严格密封,同时按照垂直顺序(A1-H1)分装样品。更多的详情请查看“PCR板”。
  2. 请用双蒸水将您的测序引物稀释至5μM(pmol/µl),每个测序反应提供5-10μl的测序引物。我们也可以为您免费提供安升达通用引物。请注意,在每个测序反应中只能使用一个引物。关于如何设计测序引物请参考“技术要点说明”。
  3. 由于EDTA会影响测序反应,为了得到高质量的测序结果,请勿使用Tris-EDTA(TE)缓冲液。


预混合服务

如果您选择此项服务,请务必详细阅读以下相关要求:

1. 登录您在安升达的账户,在线提交订单,在“服务类型”中选择“预混合”,提交电子订单并打印。

2. 参照下表,将10 μl指定浓度的DNA模板(质粒或者已纯化PCR)和 5μl的引物(5 µM)混合(若在线提交订单时选择安升达通用引物,只需按照所要求的浓度提供10 μl的DNA模板即可)。


 

服务参数

DNA类型   DNA长度
(包括载体)
模板浓度*
(10μl) 
模板总量
(10μl) 
 引物总摩尔数
(5μl)
 混合后的体积
(模板+引物)
 质粒  <6 kb  ~50 ng / µl  ~500 ng  25 pmol  15 µl
 6 - 10 kb  ~80 ng / µl  ~800 ng
 > 10 kb  ~100 ng / µl  ~1000 ng
 已纯化PCR产物  <500 bp  ~1 ng / µl  ~10 ng  25 pmol  15 µl
 500 - 1000 bp  ~2 ng / µl  ~20 ng
 1000 - 2000 bp  ~4 ng / µl  ~40 ng
 2000 - 4000 bp  ~6 ng / µl  ~60 ng
 > 4000 bp  同质粒  同质粒

* 关于如何设定Sanger测序的模板浓度(针对预混合服务)

对质粒来说,模板的浓度就是模板的碱基长度(kb)乘以10ng/µl。
即最佳质粒浓度=10 ng/µl×kb。
例如:您有一个4.5kb长的质粒(载体+插入片段),将质粒的长度(kb)扩大10倍,也就是说,该质粒最佳的测序浓度为45ng/µl。因为我们需要10µl的模板量,因此您需要提交给我们450ng的质粒。

对纯化的PCR产物来说,测序模板的浓度为模板的长度(kb)乘以2ng/µl。
即纯化的PCR产物的最佳浓度=2ng/µl×kb。
例如:您的PCR产物为700bp,将它的kb数扩大2倍。也就是说,该PCR纯化产物的最佳测序浓度为1.4 ng/µl。因为我们需要10µl的模板量,因此您需要提交给我们14ng的PCR纯化产物。

3. 将指定浓度和体积的DNA模板和引物混合于PCR 8联管中(>48个反应建议使用96孔PCR板),并按照订单上的反应的编号,在管壁上进行标记(您提交订单之后,每个反应前面会有一个管号)。

4. 将打印的订单连同样品一起邮寄至安升达,或者联系安升达的销售人员进行取样。








常规服务

建议您尽量提供已纯化的样品(质粒、已纯化PCR),这类样品我们会优先安排反应。 细菌、PCR原液及噬菌体(具有环状基因组)的测序均可选择此服务类型。对于噬菌体测序样品的要求,详见“噬菌体测序”。


1. 质粒要求

  • 质粒浓度大于50ng/µl,体积大于20µl;
  • 用双蒸水溶解;
  • 大片段质粒需要注明载体长度(>10k)。

2. 已纯化PCR

  • PCR产物溶于双蒸水中;
  • 浓度大于10ng/µl,体积大于20µl;
  • 电泳检测条带单一。

3. 菌液模板要求

  • 注明载体的抗性,我们提供Amp及kan两种抗生素;
  • 特殊抗生素请自备,并标明使用浓度;
  • 低拷贝质粒请直接提供质粒(按照质粒的要求);
  • 提供50µl左右的过夜培养的新鲜菌液,装于1.5ml离心管中封口保存,防止交叉污染或泄漏。

4. PCR原液

  • 片段通常大于200bp,低于200bp建议克隆后再测序;
  • 条带不单一的PCR产物:浓度需大于10ng/µl,体积大于20uL;
  • 条带单一的PCR产物:浓度需大于10ng/µl,体积大于10uL。

5. 引物要求

  • 浓度10µM(pmol/µl),每个反应提供5-10µl;
  • 随机引物和兼并引物不适合做测序引物;
  • 安升达通用引物以外的测序引物请自备。


安升达Sanger测序服务样品寄送地址信息

样品提交说明:

如果您是第一次使用我们的测序服务,可以拨打电话400-8100-669选项1或发送邮件至Support.Asia@Azenta.com联系安升达的技术支持进行咨询。

如果您已经使用过我们的服务,可以直接联系安升达的销售人员或者取样人员。

您可以根据地图所示将样品直接邮寄至以下地址:

安升达苏州实验室
江苏省苏州市苏州工业园区科教创新区酝慧路8号 215123
收件人:安升达Sanger测序服务 ,电话: 0512-68731001 ext. 6331

安升达天津实验室
天津武清开发区创业总部基地B06栋4-5层 301700
收件人:安升达Sanger测序服务,电话:022-59096300,转5500(周一至周五),5511(周末)

安升达广州实验室
广东省广州市黄埔区科学城科丰路31号华南新材料创新园G12栋401
收件人:安升达Sanger测序服务,电话:020-83908200

技术支持: 如果您有疑问或需要咨询项目相关事宜,可以随时联系安升达的技术支持。请发送邮件至Support.Asia@Azenta.com或拨打安升达的免费服务电话400-8100-669选项1。 安升达期待与您的合作!

 





 

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