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常规修饰引物的应用

磷酸化(Phosphorylation): 5’磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。 磷酸化可抗外切酶消化的相关实验中,也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。

生物素(Biotin):生物素修饰能够耐受热和pH。生物素化的DNA能够成功的转化进入细菌 。 引物生物素标记,可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。

地高新 (Digoxigenin):地高新是一种从毛地黄植物分离出来的类固醇物质,因为毛地黄植物的花和叶子是这种物质唯一自然来源, 所以抗地高新抗体不会结合到其他生物物质。地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置。杂交的地高新探针可以由抗地高新抗体来检测, 这个抗体一般会与碱性磷酸酶,过氧化物酶,荧光素或胶体金偶连。或者没有偶连的抗地高新抗体但偶连的抗抗体。 地高新标记的探针可用于各种杂交反应,如DNA-DNA杂交(Southern blotting),DNA-RNA杂交(Northern blotting)斑点杂交(Dot blotting ), 克隆杂交,原位杂交以及酶联免疫分析(ELISA)。

内部氨基修饰:主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离,可用于进一步的标记和酶连接(如碱性磷酸酶)。

5'氨基修饰:可用于制备功能化的寡核苷酸,广泛应用在DNA芯片(DNA Microarray)和多重标记诊断系统。目前提供5' C6 氨基修饰和5' C12氨基修饰两种, 前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物,后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记,尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。

3'氨基修饰:可用于制备功能化的寡核苷酸,广泛应用在DNA芯片(DNA Microarray)和多重标记诊断系统。目前提供5' C6 氨基修饰和5' C12氨基修饰两种, 前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物,后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记,尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。

巯基(Thiol):5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。 例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。 5'的巯基修饰主要用5'巯基修饰单体(5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite)。 用5'-Thiol-Modifier C6-CE单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基(trityl),而Thiol-Modifier C6 S-S CE单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。

Spacer:Spacer 可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用,主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。 C3 spacer 主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔,或“替代”一个序列中未知的碱基。 3'-Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。 Spacer 18 常用于引进一个强疏水基团。

硫代(Phosphorothioate):硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。 您可以选择全硫代,但随着硫代碱基的增加,寡核苷酸的Tm值会降低,为了降低这种这种影响, 可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰,通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。

脱氧脲嘧啶 (DeoxyUridine,dU):脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。 每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7 ℃。

脱氧次黄嘌呤(deoxyInosine,dI):脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基, 虽然不是真正意义上的通用碱基但当与其它碱基结合时会比其它碱基错配相对更稳定。 脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下,脱氧次黄嘌呤首选与dC结合。

 

常见染料参数

染料 吸收最大波长(nm)  荧光发射最大波长(nm)  摩尔消光系数 颜色 
FAM 495 520 83,000 Green
TET 521 536 73,000 Orange
JOE 520 548 71,000 Pink
HEX 520 548 71,000 Pink
TAMRA 544 576 90,000 Rose
Cy3 550 570 150,000 Red
ROX 576 601 82,000 Red
Texas Red 583 603 107,000 Red
Cy5 650 670 250,000 Violet