当前位置:首页>服务资源>FAQs>引物合成FAQ>

引物合成常见问题


引物常见问题解答

A:
我们的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L(即100pmol/ul)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH 7.5-8.0),开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟,防止开盖时引物散失。
A:
没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数管保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前,将浓溶液稀释成工作液后进行实验。
A:
用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。
A:

1个OD值的Oligo的重量约为33 μg,而每个碱基的平均分子量一般按330道尔顿进行计算。因此, 合成oligo的nmol数一般按以下公式粗略地计算: nmole数=(OD值x33μg)/(碱基数x330)x1000=OD值/碱基数x100

如果需要计算合成DNA的精确浓度,请按以下公式进行计算: nmole数=(OD值x1000)/[ (15.3xA#)+(7.4xC#)+(11.8xG#)+(9.3xT#) ]

A:
通常在合成长链引物时,试剂的加入量要比短链引物多很多,尤其是大于90bp以上的引物,由于成本的增加,从而导致价格也要增加。

DNA合成常见问题

A:
实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)。
A:
没有,5和3末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,则需要使用修饰合成增加磷酸化。
A:
由于核酸在260nm附近有强吸收,而蛋白质在280nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8~2.0之间),这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同,序列很短 (通常在20~30个碱基之间),其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同,例如当序列中C、T碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度。
A:
对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带,更无法用Agarose电泳进行定量了。
A:

PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。

  • 引物和模板是否配对,同源性有多大;
  • 引物本身是否有立体结构;
  • PCR反应用试剂是否能正常工作;
  • PCR仪是否工作正常;
  • PCR反应条件是否合适;
  • 如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。
A:
不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EB染色。由于不同引物的序列不同,形成双螺旋的能力不同,因此染色能力不尽相同,也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。
A:
  • 因为引物纯度不可能是100%,因此,挑选克隆时,有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时,请重新挑选一个克隆测序,会得到正确的结果。
  • 如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观,我们会免费重新合成引物并以最快的速度送到您的手里。
  • 如进行索赔时,按国际行业惯例,索赔范围限于制品价格范围之内。