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分子生物学常见问题


菌种鉴定
A:
传统的菌种鉴定主要依据形态特征和生理性状,需要进行分离培养及一系列生化反应或免疫学检测。方法复杂费时,对有些菌种也往往不能给出理想的鉴定结果。 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。金唯智的菌种鉴定服务,采用Sanger测序的方法,比传统的生化鉴定更加的快速,准确。
A:

生物细胞DNA分子的一级结构中既具有保守的片段,又具有变化的碱基序列。保守的片段反映了生物物种间的亲缘关系,而高变片段则能表明物种间的差异。利用保守区设计引物扩增高变区进而进行比对分析,就能区分不同的物种信息。

通过扩增测序的方法进行菌种鉴定,大多只能鉴定到属,如需鉴定至种,还要如DNA杂交,生理生化指标等的综合判断。

A:
细菌16S rDNA部分序列分析:扩增细菌16S rRNA前500 bp的片段,只需进行一个测序反应,即可得到含有部分种属特异性的16S信息,是一种较为经济便捷的鉴定方法。

细菌16S rDNA全序列分析:扩增细菌16S rRNA的全长序列,约1,500 bp左右,TA阳性克隆需进行三个测序反应,以得到较为全面的种属特异性信息。

真菌ITS区:ITS位于18S和5.8S rDNA(ITS1)之间以及5.8S和28S rDNA之间(ITS2),是中度保守区域,种内相对一致,种间差异明显,适合于等级水平较低的系统学研究。需要对两个区域进行扩增和测序分析。

真菌18S:广泛用于分析真菌菌株之间的差异,约1,500 bp左右,TA阳性克隆进行三个测序反应,得到较为全面的种属特异性信息。

真菌26S rDNA D1/D2区:真菌大亚基上的26S rDNA分子,可分为D1、D2…D12等多个区域,其中D1/D2区域长度500 bp左右,可用于对真菌进行鉴定。该方法尤为适合对酵母菌进行鉴定。
A:
金唯智不接受有致病性的样品。如果您的菌体带有致病性,请您提供给我们菌体的基因组DNA或者将菌体进行加热处理以杀死该致病菌,并放入我们指定的缓冲液进行邮寄。
A:
金唯智的菌种鉴定服务采用PCR扩增、测序的方法,即以客户提供的菌株为模板直接进行PCR扩增,中间不经过传代培养,因此不会引入新的污染,如果出现结果不一致的情况,一般有以下原因导致:

1)您提供的样品含有其他杂菌; 2)您提供样品的真实情况确认如此。建议您提供三次纯化的菌株重新进行鉴定。
A:
 客户样品PCR扩增失败的可能原因有:

1)客户提供的菌种从严格意义上讲不是细菌或者真菌,或者客户提供信息有误;

2)客户提供的是革兰氏阳性菌,由于细胞壁较厚,采用常规方法不能有效地破壁;

3)培养基或菌体中含有抑制PCR的组分。

对于第二种和第三种,需要用基因组DNA。
A:

测序结果出现套峰的可能原因:

1)测序结果个别碱基出现N,或者部分连续出现套峰,是由菌种rDNA多态性造成,对菌种鉴定无影响;

2)所有测序反应均出现大面积套峰,由于客户提供样品模板不纯造成,这种情况需要客户重新纯化菌种或进行TA克隆。

微卫星(STR/SSR)分析
A:
微卫星,也叫做短串联重复序列(STRs)或简单重复序列(SSR),是指少数几个核苷酸(一般为1~6个)为重复单位组成的简单多次串联重复序列,其长度大多在100bp以内。微卫星标记由核心序列和两侧保守的侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域。核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。微卫星上不同长度的等位基因按简单的孟德尔方式遗传,在基因组中含量丰富且分布均等,因此是一种十分理想的分子标记。
A:
微卫星序列,也叫做短串联重复序列(STRs),广泛存在于各类真核基因组中,它具有多态性丰富、重复性好、呈孟德尔共显性遗传,检测快速方便及结果稳定可靠等特点广泛应用于遗传图谱构建、数量性状位点(QTL)定位、标记辅助选择、遗传多样性评估、遗传检测等研究领域。
A:

通过普通PCR筛选得到适宜引物,然后进行荧光PCR扩增,扩增产物进行毛细管电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。

PCR扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测,传统采用聚丙烯酰胺凝胶电泳加放射显影或银染的方法,费时费力效率低。金唯智采用ABI遗传分析仪对荧光标记DNA片段进行检测,加上分子量内标进行DNA片段长度计算,使STR分型变得高效快捷,结果也更加精确可靠。

A:
金唯智有多年的微卫星分析经验,成功对植物,昆虫,鱼类、哺乳动物等物种进行STR检测。我们合作的单位包括国内外多所高校(北京大学、四川大学、南京大学、西南大学、中国农业大学、军事医学科学院、北京林业大学、东北林业大学等)、科研单位以及制药和生物技术企业等。
细胞系鉴定
A:
细胞株被错误识别及交叉污染等现象很普遍。据统计,15-20%实验中所使用的细胞已经不是原来的细胞系,或者发生了交叉污染;国外15-25%的研究论文因为使用了被交叉污染和错误识别的细胞对研究产生了巨大的影响(如研究结果前后不一致或不可重复、错误的结论等),同时还浪费时间、精力和金钱。目前有些杂志要求在投稿时提供细胞STR分型图谱,NIH等机构已经强烈建议将细胞系鉴定作为基因申请审批的一个必要条件,因此细胞鉴定尤为重要。
A:
    Cancer discovery

    Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention

    Clinical cancer research

    Molecular Cancer Research

    Molecular Cancer Therapeutics

    Cancer research

    Cancer Prevention Research

    Cancer Immunology Research

    In Vitro Cellular and Developmental Biology – Animal

    Bio techniques

    Cell Biochemistry and Biophysics

    Cell Death & Disease

    International Journal of Cancer
A:
金唯智所使用的试剂盒有:Promega公司注册商标生产的相关系列试剂盒; 基点认知技术(北京)有限公司生产的试剂盒;金唯智公司自主研发的试剂盒
A:
细胞STR鉴定主要应用于将人源细胞系用于研究和生产的用户,包括但不限于以下领域:分子遗传学,生物化学,细胞生物学,肿瘤生物学,神经生物学,药物开发,疫苗研制,生物技术和制药行业,再生医学, HIV的检测和治疗等领域。

金唯智已为国内外多所高校(南开大学、军事医学科学院等)、科研单位以及制药和生物企业提供优质的细胞系鉴定和STR分析服务。
A:
商业化试剂盒的检测结果与ATCC、DSMZ等官网数据比对,根据官网的算法出具同源率数据;金唯智公司研发的平台,根据公司内部算法出具比对结果。
SNP检测与突变分析
A:
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)是在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性, 在群体中的频率不小于1%。SNP在人类基因组中的发生频率比较高,大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点,其包括碱基的转换、颠换、插入、缺失。具有数量大,分布广及高度稳定性等特点,是第三代遗传标记。
A:
单核苷酸多态性(SNPs)是广泛存在于基因组中的一类DNA序列变异,其频率为1%或更高,其稳定可靠,并通常以二等位基因的形式出现。作为新一代分子标记,SNP在动植物遗传图谱构建、品种鉴定、物种起源与亲缘关系、群体遗传、分子育种、生物进化、疾病诊治及药物基因组学等诸多领域具有广阔的前景。
A:
金唯智可采用Sanger测序法、Taqman探针法和质谱法进行SNP检测。

Sanger测序法:通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异。通常情况下,纯合型SNP位点的测序峰为单一峰型,而杂合型SNP位点的测序峰为套峰,因而很容易将其区分开,通过该方法进行SNP检测的检出率接近100%,是使用最广泛的一种检测方法。

Taqman探针法:其核心是利用Taq酶的3’-5’核酸外切酶活性,切断探针,产生荧光信号。针对不同的SNP位点需分别设计一对PCR引物和Taqman探针,适用于多样品少量SNP位点的检测。

质谱法:MassARRAY SNP分型技术结合了准确的引物延伸、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的优点,能够快速、经济、高重现性地进行SNP的分型验证。通常单次可以对384个样品进行25个SNPs位点检测,非常高效经济。
A:
金唯智有多年的SNP检测经验,成功对人、水稻、雪豹、赤拟谷盗、出血热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、细菌、真菌等物种进行SNP检测。我们合作的单位包括国内外多所高校(北京大学、清华大学、天津医科大学、兰州大学、南开大学、中山大学、中国科学技术大学、四川大学、河南农业大学、郑州大学等)、科研单位以及制药和生物技术企业(北大第一医院、医科院肿瘤医院、华西医院、301医院、阜外医院、诺和诺德、和记黄埔、诺华、广州金域医学检验中心、中国科学院等)。
荧光定量PCR
A:
常规PCR技术:对PCR反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时监测。

荧光定量PCR:利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。荧光定量PCR具有敏感性高,需要样品量少,特异性高,可以精确定量等的特点。
A:
荧光定量PCR的应用范围非常广泛,可以应用于基因扩增、扩增特异性分析、基因定量分析、基因检测、基因分型、SNP分析、单/多基因表达研究、高通量基因表达谱研究,疾病的早期诊断,遗传病的早期诊断,药物研究,及肿瘤的诊断,食品安全(病原微生物检测,转基因食品检测动物疫病检测)等。
A:
金唯智可以提供相对定量和绝对定量PCR,采用SYBR Green I法和Taqman探针法进行荧光定量PCR。

SYBR Green I法:

原理:SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料,与双链DNA结合后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。在PCR反应体系中,加入过量SYBR Green 荧光染料,SYBR Green 荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR Green染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

优点:对模板没有选择性,适用于任何DNA,使用方便(不必设计探针),非常灵敏,性价比高。

缺点:容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性(可以通过溶解曲线的分析,优化反应条件),对引物的特异性要求高。

 

Taqman探针法:

原理:Taqman探针是最早用于定量的方法。其核心是利用Taq酶的3’-5’核酸外切酶活性,切断探针,产生荧光信号,从而使荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

优点:对目标序列的高特异性,设计相对简单(与目标序列某一区域互补),重复性好。

缺点:每个检测基因需单独设计探针,价格相对较高,不易找到本底低的探针。

 
单克隆抗体测序
A:
单克隆抗体测序可以提供包括重链及轻链可变区、恒定区序列,可变区、恒定区的核苷酸及氨基酸序列分析,V(D)J区结构分析;

此外,我们还可以结合客户的需求,协商定制化信息分析内容。
A:
对于利用抗体开发生物制药等客户,我们可提供经过FDA认证的GLP/cGMP规范化的序列检测和质粒制备服务,充分满足各种客户的需求。
A:
金唯智在抗体测序领域建立的高效完善的技术流程依托于Sanger测序平台以及高通量测序平台,对于高通量测序平台,可以根据需求选择Illumina HiSeq 2500、Illumina MiSeq或Ion Torrent(PGM)平台。
A:
抗体测序主要应用于将抗体用于研究和生产的用户,包括但不限于以下研究领域:免疫研究、传染性疾病研究、肿瘤免疫研究、B细胞血液病研究、白血病研究、抗体药等生物医学领域。