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Sanger测序常见问题


收费标准

A:
判读结果 是否收费
弥散 不收费
气泡 不收费
光谱拉高 不收费
衰减 不收费
高背景 不收费
无信号 不收费
成功 收费
引物问题 收费
套峰 收费
poly结构\重复序列 收费
中断 收费*

*金唯智会为您安排部分样品进行特殊方案重测。如果您希望剩余样品也进行重测,请直接回复邮件。
说明:针对判读结果为“中断”的订单,并非所有复杂结构都适用特殊方案并测序成功,所以您要求的重测反应成功与否都将收费。
由于样品自身原因造成的测序失败(无信号、衰减等),经验证或沟通确认,均将放行并收费。

客户账号
A:
在公司网站主页(www.genewiz.com.cn)的右上角,点击“注册”,就可以注册新账号,请填写您的登录名(您的E-mail地址)和密码。这个过程仅需要几分钟的时间,然后您会收到账号激活的邮件,点击其中的链接即可,激活后可以马上使用。准备提交您在金唯智的第一个订单吧!
A:
欢迎使用金唯智的服务!我们会提供给新客户一份金唯智新客户体验券来免费试用我们的Sanger测序服务。需要您做的就是发送邮件至Support.Asia@genewiz.com.cn 或拨打金唯智的免费服务电话400-8100-669选项1,以了解更多的服务信息。
A:
当然可以!我们欢迎全世界的顾客。在建立账号的过程中,会被要求填写所在城市,如果您身处国外,请在下拉菜单中选择“其它”,并请提供正确的城市和邮编。所有其它的地区请按实情填写。
A:

金唯智始终遵循“以客户为导向”的经营理念。我们已经成为Sanger测序和包括基因合成在内的分子生物学服务的领军者之一,能够为客户提供最佳价值组合:快速提交结果、专业的技术服务、具有竞争力的价格以及细致周到的客户服务。

欢迎您选择金唯智!

Sanger常规测序样品的制备

A:
常规测序服务是指针对各种类型DNA模板的测序。客户分别提交测序模板和引物(或者使用金唯智的通用引物),由金唯智测定样品的浓度,确定测序反应的使用量,然后进行的测序。
A:

绝大多数的测序反应结果都没有问题,但是注意以下几点可以尽量避免产生不理想的测序结果。 以下是我们的样品准备指南,以帮助您优化测序结果:

1)尽量遵循Sanger测序样品制备指南的要求制备样品。DNA模板和测序引物的质量是影响测序结果的主要因素。

2)确保您的引物与模板完全匹配。引物与模板不完全匹配可能导致测序结果不佳。测序引物长度应在18-24bp之间,退火温度56-60℃,GC含量45-55%。

3)避免污染物的污染。盐、EDTA、酒精、蛋白、RNA、洗涤剂、铯和苯酚是最常见的污染物,会造成测序结果不佳或测序失败。

4)请确保选择正确的测序服务类型。对于某些特殊的模板(如含发卡结构或富含GC的模板),为了得到好的测序结果,请在测序订单中注明其“序列特点”。

A:
我们保证一个成功的测序反应的有效读长是800bp。如果您的目的片段大于800bp,您可以选择测通,我们会根据您的插入片段长度设计引物进行加测。
A:
质粒、PCR产物(PCR已纯化或者单一条带的PCR原液)、细菌(菌落或甘油菌)、环状基因组的噬菌体(噬菌体上清液或噬菌斑)都可以进行。 “预混合服务”只针对质粒和已纯化PCR。
A:
登录您的金唯智账户,点击账户信息下的邮件配置,选择您想要接收的邮件。
A:
对于测序要求为测通的订单我们会为您直接拼接的,如无法拼接会为您设计引物加测直至可以拼接;您也可以在订单备注“需拼接”或电话,邮件与我们联系要求拼接结果。
A:
请尽量遵循Sanger测序样品制备指南的要求准备样品。
A:
建议您使用分光光度计,如NanoDrop,检测260/280和260/230的比值来检测样品的浓度。也可以利用一小部分DNA样品通过琼脂糖电泳,并利用已知浓度的marker作为参照,进而确定DNA模板的浓度。
A:
长度小于200bp的样品不适合测序验证,建议将片段克隆后再用质粒进行测序。
A:
可以!金唯智有针对复杂结构的测序方案,能够成功地对富含GC的和含复杂二级结构如发卡结构的模板进行测序。在提交订单时,请在“序列特点”选择样品的序列特点。
A:
除特殊情况外,模板和引物的保存时间是1个月。由于菌液和平板菌落很容易老化,我们的保存时间是半个月。如果您的DNA样品和引物还要用于后续订单,请将此注明在订单的“备注”部分。 我们不建议您使用保存时间过长的样品进行测序。如果您需要加测,建议您重新送样品和引物。 建议您每次在送样时对样品备份。如果多次测序使用完了您送的样品,我们一般不负责重新制备。
A:
请将您的PCR模板和引物分开存放,并贴好标签。建议提供一张模板的凝胶照片,并注明上样量。在提交订单时,请在服务类型中选择“需切胶PCR原液”,我们会根据您的凝胶照片对PCR产物进行纯化并优化测序结果。
A:
您可以任何品牌的PCR板和盖子。请保证你的样品在96孔板中是成列或垂直方向排列即可。
A:
我们建议您在送样前保留一份样品的备份,防止样品在邮寄过程中丢失等不可抗拒的因素影响。
Sanger测序结果
A:
在测序仪中,每个含荧光标记末端的片段,经毛细管电泳至指定位置时会释放出荧光信号,该信号被CCD图像传感器捕获。记录下荧光信号的峰值被最终整理生成轨迹数据文件(即序列图谱,*.ab1文件)。不同的碱基使用不同颜色的荧光标记,使用序列分析程序即可根据这些峰值判断出对应的碱基。
A:
碱基的质量值(Quality Value)用于量化评估该碱基的可信度,由序列分析程序根据该碱基的峰形计算得出(QV = -10log10Pe;Pe—Probability of Error, 误差率)。QV越高,误差率越低。QV与Pe的对应关系为: 质量值(QV) 误差率(Pe) 1~10 79%- 10% 11-20 7.9%-1.0% 21-30 0.79%-0.10% 31-40 0.079%-0.010% 50及以上 0.001%及以下
A:
测序结果的序列质量得分(Quality Score, QS)是序列中所有碱基质量值(Quality Value)的平均值,用于判断测序结果整体的可信度。 关于有效读长,金唯智选用的标准为序列连续读长(Contiguous Read Length,CRL)。即整个序列中,各个碱基质量值均大于20(可信度大于99%)的片段里,最长片段的长度。
A:

测序结果无任何明显干扰,前800bp连续可读。通常菌液或质粒样品,一个测序反应读长可达1000bp,由于Sanger测序的局限性前50bp可能存在误差;PCR产物测序常以终止信号A尾结束。

点击查看峰图实例

引物相关问题

A:
建议您在目标序列上游100bp处设计测序引物。如果没有缓冲区域,就在序列上游的50-60碱基处设计引物。但是与目标序列越靠近,就越容易错过部分目标序列。引物的长度应为18-24bp,退火温度为56-60℃,GC含量为45-55%。您也可以利用引物设计软件来设计引物,主要影响因素包括引物的Tm值、GC含量和二聚体。
A:
可以。如果您知道引物的序列,仅需要在测序订单中注明即可。如果您需要金唯智为您设计引物,请在订单中注明目标序列中的相关信息发邮件至Support.Asia@genewiz.com.cn
A:
请点击查看金唯智提供的通用引物
您可以使用同一页面中的金唯智通用引物选择工具,查询测序所需的引物。

疑难解答

A:
我们可以免费为您解决测序过程中遇到的各种难题。如果测序失败,我们会发送给您一份说明文件,标注出失败原因,您也可以联系我们的技术支持 ,或者发送邮件至Support.Asia@genewiz.com.cn来寻求帮助。
A:
针对无信号、高背景和衰减三种失败类型,我们将按照一定的比例安排重测,若重测结果成功,则将与其失败原因相同的其他样品按照同样的方法安排重测。您可以联系我们的技术支持 ,或者发送邮件至Support.Asia@genewiz.com.cn来寻求帮助。
A:
当聚合酶遇到序列中的polyA或polyT时,往往会发生移滑,进而导致测序结果的非特异性或不理想。每当出现这种情况时,我们就会建议进行反向测序,以得到缺失的序列数据。
A:
引物越长,Tm值就越高,测序反应过程中的DNA模板就越不容易退火,可能就会产生不理想的结果。我们建议您使用金唯智通用引物或者您自己设计的引物长度要在18-24bp之间,退火温度为56-60℃,GC含量为45-55%。
A:
最有可能的原因是引物降解,另一个原因可能是您的PCR引物虽然适合于PCR反应,但是不适合用于测序反应。我们建议您的测序引物长度在18-24bp之间,退火温度56-60℃,GC含量为45-55%。PCR引物越长,测序结果可能越不理想。而且,并不是所有的PCR引物都适合被用做测序引物。如果您的PCR引物对测序结果不利,我们建议您设计巢式引物来作为测序引物。
A:

Sanger测序常见的失败类型如下,请点击链接查看具体的原因及解决办法。

Poly结构或重复序列

高背景

光谱拉高

弥散

气泡

衰减

套峰

无信号

引物问题

中断